大孔树脂分离纯化横山老黑豆酚类物质

2019-10-30朱怡霖张海生赵鑫帅薛焕焕孙钰涵

食品与生物技术学报 2019年9期

朱怡霖，张海生，赵鑫帅，薛焕焕，薛菁，孙钰涵

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119）

黑豆是植物中营养丰富的保健佳品，具有延缓衰老等生物活性，酚类物质是重要的生理活性物质[1-6]。横山老黑豆是榆林地区重点培育的黑豆品种之一，分析横山老黑豆中的多酚及其组成成分，并用大孔树脂分离纯化横山老黑豆生物活性物质[3]。黑豆中含有较高的酚类化合物[7-8]，主要分布于种皮中，黑豆中的酚类化合物远高于黄豆，鉴定出黑豆中含有没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、香豆酸、绿原酸等酚酸类物质和大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、染料木苷和染料木素等12种异黄酮[7，9-10]。已有研究表明黑豆多酚具有较高的抗氧化、抗肿瘤和抑制前列腺增生等生物活性，但黑豆多酚的分离纯化和鉴定方面的研究鲜见报道[11-14]。大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、再生处理方便、节省费用等优点，是一种常用有效的分离纯化多酚物质的方法[14-16]。不同物质的多酚物质种类及含量差异较大，不同种类的大孔树脂对酚类物质的分离纯化效果也存在较大的差异[17-18]。作者以横山老黑豆为原料，通过比较8种大孔树脂对横山老黑豆酚类化合物的吸附和解吸特性，筛选出对横山老黑豆酚类化合物具有较好的吸附和解吸性能的树脂，建立横山老黑豆多酚物质分离纯化工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要仪器

横山老黑豆：横山种子公司提供。

大孔树脂：AB-8、D101、NKA-9 和 NKA-Ⅱ，西安蓝晓科技有限公司产品；大孔树脂：X-5、LSA-21、XDA-1、HPD-700：陕西蓝深特种树脂有限公司产品。

没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸：购自Sigma公司；大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、染料木苷和染料木素购于上海源叶生物科技有限公司。

U-3000高效液相色谱仪-Thermo：美国热电公司产品；KQ3200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；Multiskan Go全波长酶标仪：美国热电公司产品；SHZ-B水浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理取一定量横山老黑豆粉碎过60目筛，准确称取90 g，加入900 mL石油醚振荡脱脂24 h，挥干溶剂，用体积分数80%的甲醇以料液体积比1 g∶15 mL于超声提取仪40℃提取30 min后，3 000 r/min离心15 min后收集上清液，残渣以同样方法重复提取2次，合并3次提取液，40℃下真空浓缩得横山老黑豆多酚粗提液。置于-20℃保存，备用。

1.2.2 多酚的测定方法采用Folin-Ciocalteau法测定多酚含量[19]，准确移取提取液0.1 mL，分别加入0.5 mL蒸馏水和 0.1 mL Folin-Ciocalteu试剂，3 min后加入7.5 g/dL碳酸钠溶液0.3 mL，于漩涡混合器中混合，置于25℃水浴避光反应2 h，以0.1 mL蒸馏水代替样品做空白，在760 nm波长处用酶标仪测定吸光度A。以没食子酸作标准品代替样品作标准曲线，得到回归方程y=0.005 1x+0.003，R2=0.999 3。多酚质量分数以没食子酸的质量分数（GAE）表示，单位为 mg/g。

1.2.3 大孔树脂的预处理将各树脂用无水乙醇室温下密封浸泡24 h，用蒸馏水洗至无醇味，用质量分数5%盐酸溶液浸泡8 h，蒸馏水洗至中性，再用质量分数5%氢氧化钠溶液浸泡8 h，蒸馏水洗至中性，备用。

1.2.4 大孔树脂的筛选准确称取各处理好的湿树脂 AB-8、D101、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、LSA-21、XDA-1和HPD-700各1 g，置于50 mL锥形瓶中，各加入0.11 mg/mL横山老黑豆样品提取物10 mL，置于25℃恒温摇床中振荡吸附24 h，抽滤，取滤液测定树脂对总酚的吸附量。取上述吸附饱和树脂，再分别置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL体积分数70%乙醇，置于25℃恒温摇床振荡解吸24 h，使树脂被充分洗脱后，取洗脱液测定吸光度并计算解吸率，选取吸附量、吸附率及解吸率（洗脱率）较高的树脂。树脂吸附量、吸附率与洗脱率按如下公式计算[20]：

式中：Q吸附量（mg/g）；C0吸附前酚类质量浓度；C1吸附后平衡液中酚类质量浓度；V1吸附溶液体积；W树脂质量（g）；A吸附率（%）；D洗脱率（%）；C2洗脱液中酚类浓度；V2洗脱液体积。

1.2.5 大孔树脂静态吸附、解吸试验乙醇体积分数对静态解吸率的影响：准确称取筛选出来的经处理的湿树脂5份各1 g，分别置于50 mL锥形瓶中，均加入10 mL横山老黑豆多酚粗提液，放于25℃恒温摇床中振荡24 h，然后将吸附平衡的树脂取出，过滤，再分别置于50 mL锥形瓶中，加入不同体积分数（25%、40%、60%、70%和80%）的乙醇溶液10 mL，置于25℃恒温摇床振荡解吸24 h，取洗脱液测定吸光度并计算解吸率。

静态吸附动力学曲线：准确称取经处理的湿树脂1 g，置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL横山老黑豆多酚粗提液，放于25℃恒温摇床中静置，每隔30 min振荡2 min并取100 μL上清液，按照1.2.2的方法测定多酚含量，绘制吸附动力学曲线。

1.2.6 大孔树脂动态吸附和解吸试验将筛选出来的树脂湿法装柱（柱长50 cm，D3 cm）。用蒸馏水平衡后，将不同质量浓度（0.49、0.98、1.96 mg/mL）和不同流量（1.50、2.14、3.00 BV/h）的多酚样品进行上样，收集流出液并测定不同体积流出液的多酚质量浓度，每20 mL流出液为一管收集并采用Folin-Ciocalteau法测定多酚质量浓度。当流出液中多酚浓度达到上样液质量浓度的10%时即为泄漏点。吸附平衡后用大量的蒸馏水冲洗，去除水溶性蛋白、还原糖和多糖等杂质，再用体积分数70%乙醇溶液以一定流速洗脱，按照1.2.2的方法测定多酚质量分数。

1.2.7 横山老黑豆酚酸及异黄酮的HPLC分析采用HPLC法测定经筛选的大孔吸附树脂分离纯化后的横山老黑豆酚酸及异黄酮的组成和含量变化[21-22]。取上述处理过的样品1 mL，0.45 μm滤膜过滤。采用 Thermo U-3000 HPLC系统，Diamonsil C 18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。酚酸的 HPLC条件：流动相乙腈（A）和体积分数1%冰乙酸（B）溶液，检测波长 280 nm，柱温30℃，流量1.0 mL/min，进样量20 μL，HPLC的总运行时间为50 min。梯度洗脱条件：0～5 min，5%～15%A；5～35 min，15%～35%A；35～40 min，35%～45%A；40～50 min，45%～5%A。异黄酮的HPLC条件：流动相乙腈（A）和体积分数0.1%冰乙酸（B）溶液，检测波长 260 nm，柱温20 ℃，流量 1.0 mL/min ，进样量 20 μL，HPLC 的总运行时间为50 min。梯度洗脱条件：0～5 min，5%～15%A；5～35 min，15%～35%A；35～40 min，35%～45%A；40～50 min，45%～5%A。样品的定性与定量通过与标品的出峰时间和峰面积来确定。

1.2.8 数据统计分析采用 SPSS 17.0软件（SPSSInc，Chicago，IL，USA）进行统计分析，数据结果以平均数±标准差（n=3）表示，采用Duncan多元回归方法分析0.05水平上均值的显著性差异。

2 结果

2.1 不同的大孔树脂对横山老黑豆多酚吸附和解吸结果

由图1表明，8种所选树脂对横山老黑豆多酚的吸附量存在显著性差异，NKA-Ⅱ的吸附量最高为 0.73 mg/g，其次为 NKA-9和 HPD-700（吸附量分别为0.67 mg/g和0.65 mg/g），其余5种树脂的吸附量较低并与以上3种树脂存在显著性差异。图2表明，NKA-9和LSA-21多酚解吸率均较大（解析率分别为83.52%和85.03%），两者之间无显著性差异，NKA-Ⅱ的多酚解吸率最低（58.46%）。综合考虑大孔树脂对横山老黑豆多酚的吸附量和解吸率，NKA-9型大孔树脂不仅具有较强的吸附性，而且也具有较强的解吸能力，因此选用NKA-9型大孔树脂进行横山老黑豆多酚的分离纯化研究。

图1 不同的大孔树脂对横山老黑豆多酚的静态吸附量比较Fig.1 Comparison ofstaticadsorption capacity of different macroporous resins to polyphenols in Hengshan black soybean

2.2 静态吸附、解吸结果

乙醇体积分数对NKA-9树脂静态解吸率的影响如图3所示，随着乙醇体积分数的增加，横山老黑豆多酚的解析率在70%之前逐渐增加，70%以后下降，乙醇体积分数为70%时，多酚解析率最大，因此，选用70%乙醇溶液作为多酚的解吸剂。

NKA-9型大孔树脂吸附横山老黑豆多酚的动力学曲线如图4所示，NKA-9对横山老黑豆多酚的吸附量在2 h内快速上升，在4 h其吸附多酚的量达到平衡。

图2 不同的大孔树脂对横山老黑豆多酚的静态解析率比较Fig.2 Comparison ofstaticdesorption capacity of different macroporous resins to polyphenols in Hengshan black soybean

图3 乙醇体积分数对静态解吸率的影响Fig.3 Influence of ethanol volume fraction on static desorption percentage

图4 NKA-9树脂的静态吸附动力学曲线Fig.4 Adsorption kinetics of NKA-9 macroporous resin

2.3 样品质量浓度对NKA-9大孔树脂吸附性能的影响

上样流量为2.14 BV/h时，样品质量浓度对NKA-9吸附性能的影响如图5所示，上样质量浓度越大泄漏点出现的越早。上样浓度为0.49 mg/mL时，在12BV体积出现泄漏点，上样时间过长，工作效率低。上样质量浓度为0.98 mg/mL和1.96 mg/mL时，泄漏点分别在10 BV和7 BV出现，树脂吸附量分别为2 744.0 mg和3 841.6 mg。在泄漏点处，上样质量浓度为1.96 mg/mL时，NKA-9大孔树脂对横山老黑豆多酚提取物的吸附量最大，上样时间短。提取物上样质量浓度达到2.55 mg/mL时样品黏度较大容易堵塞层析柱。因此，选取1.96 mg/mL为上样质量浓度。

图5 样品质量浓度对NKA-9树脂吸附性能的影响Fig.5 Impact of sample concentration on the adsorption properties of NKA-9 resin

2.4 上样流量对大孔树脂吸附性能的影响

上样流量对NKA-9吸附性能的影响如图6所示，上样流量越大泄漏点出现越早，上样流量为3.00、2.14、1.50 BV/h 时，泄漏点分别在 4、7、11 BV附近出现，树脂对横山老黑豆多酚的吸附量分别为1 097.6、1 920.8和 2 744.0 mg。可以得出，上样流量为1.50 BV/h时，泄漏点出现最迟，树脂吸附量最高，但上样时间太长，不利于实际应用。上样流量为3.00BV/h时，泄漏点出现较早，但树脂吸附量较低。上样流量为2.14 BV/h时，泄漏点出现相对较早，吸附量相对较高。因此，选取2.14 BV/h为最佳的上样速度。

图6 样品质量浓度对NKA-9树脂吸附性能的影响Fig.6 Impact of sample rate on the adsorption properties of NKA-9 resin

2.5 横山老黑豆酚酸、异黄酮及单体组成

NKA-9大孔树脂纯化横山老黑豆酚酸的前后HPLC色谱图如图7所示，横山老黑豆酚酸纯化前保留时间5min前的杂峰经NKA-9树脂纯化后杂峰被有效去除，纯化前保留时间大于5 min的峰变化不大，所测的8种酚酸（没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸）均被保留，表明NKA-9大孔树脂适于分离纯化横山老黑豆酚酸。横山老黑豆中所检测的8种单体酚酸种类及纯化前后的质量分数见表1，其中质量分数最高的是原儿茶酸，占8种酚酸的65.82%，其次是绿原酸和咖啡酸，两者酚酸的质量分数占8种酚酸的26.60%，以上3种酚酸的质量分数占所测8种酚酸的92.43%。

NKA-9大孔树脂纯化横山老黑豆异黄酮的前后HPLC色谱图如图8所示，横山老黑豆异黄酮纯化前保留时间2～10 min之间存在许多杂峰，经NKA-9纯化后杂峰被去除，且所检测的5种异黄酮（大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）均得到很好的保留，表明NKA-9大孔树脂适于分离纯化所检测的5种横山老黑豆异黄酮，但色谱峰中有两种相对较高的峰在分离纯化前后有较大的变化，还有待进一步研究。5种异黄酮种类及纯化前后的含量见表2，大豆苷和染料木苷的质量分数较高，占所测5种异黄酮总质量分数的88.87%，保留率也较高均在90%以上。其次是黄豆黄苷，占5种异黄酮的10.55%，保留率为85.26%。

图7 NKA-9大孔树脂纯化前和后的横山老黑豆酚酸HPLC谱Fig.7 Chromatograms of phenolic acids of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

3 讨论

3.1 不同的大孔树脂对酚类物质吸附性能的影响

大孔吸附树脂的吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果。同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。大孔树脂对横山老黑豆多酚类物质的吸附存在一定的选择性。作者考察了8种不同极性和特性的大孔树脂，以筛选出吸附量和解析率均较好的大孔树脂用于分离横山老黑豆酚类物质。8种树脂的筛选结果表明，极性的NKA-9和非极性的NKA-Ⅱ都具有较高的吸附性能。由此可见，横山老黑豆多酚类物质中既具有极性较大的酚类物质也存在非极性的酚类物质。解析率结果表明，非极性的NKA-Ⅱ树脂的解析性能较低，而极性的NKA-9树脂却具有较好的解吸性能，这表明横山老黑豆酚类物质可能与树脂的比表面积及平均孔径关系较大。陶莎等[23]研究了 5种不同型号的大孔树脂（S-8、HPD600、D4020、AB-8和NKA-9）对红小豆多酚的吸附分离效果，结果表明，极性的HPD 600树脂效果较好。甘芝霖等[17]比较了4种大孔树脂（ADS-17、AB-8、NKA-9和D101）对玫瑰果多酚的吸附分离效果，筛选出弱极性的AB-8为最佳的吸附树脂类型。由此表明，不同物质所含的酚类物质不同，用于酚类物质分离纯化的最佳的大孔树脂的类型差异也较大。

图8 NKA-9大孔树脂纯化前和后的横山老黑豆异黄酮HPLC谱Fig.8 Chromatograms of isoflavone of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

表1 NKA-9树脂分离纯化前后横山老黑豆酚酸种类及质量分数比较Table 1 Composition and content of phenolic acids of Hengshan black soybean before and after NKA-9 macroporous resin purification

表2 NKA-9树脂分离纯化前后横山老黑豆异黄酮质量分数的比较Table2 Composition and contentof?isoflavoneof Hengshan black soybean beforeand after NKA-9 macroporous resin purification

3.2 样品质量浓度和上样流量对大孔树脂的影响

样品浓度及上样流量也对树脂的吸附性能产生影响。苏东晓等[16]研究了样品质量浓度（3.2、1.6、0.8 和 0.4 mg/mL）和上样流量（4.5、3.0、1.5 BV/h）对HPD-826吸附荔枝果肉多酚泄漏点和吸附量的影响，结果发现样品质量浓度和上样流量分别为0.8 mg/mL和3.0 BV/h时，吸附效率较高。李琼等[24]考察了核桃青皮多酚质量浓度（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL）和上样流量（2、3、4 mL/min）对 AB-8 大孔树脂吸附泄漏曲线的影响，结果发现样品质量浓度和上样速量分别为3、2 mL/min时，AB-8树脂具有较高的吸附性能。作者分析样品浓度和上样流量对NKA-9树脂分离横山老黑豆多酚发现，样品质量浓度越大泄漏点出现越早，树脂吸附量越大，这种现象可能是样品中多酚质量分数越大与树脂的接触机率越高，树脂对多酚的吸附越多。样品质量浓度过低会导致上样时间过长不利于实际应用，质量浓度过大则有可能导致柱子阻塞。上样流量对NKA-9树脂分离纯化横山老黑豆多酚也具有很大影响，上样流量越大泄漏点出现越早，但树脂吸附量较少。上样流量过小泄漏点出现时间过长不利于操作，因此选取中等流量进行上样。

3.3 横山老黑豆酚类物质组成

利用HPLC方法对横山老黑豆中酚酸的组成进行了研究，检测出8种酚酸化合物，其中原儿茶酸是横山老黑豆的主要酚酸组成物质，占所检的8种酚类质量分数的50%以上，其次绿原酸和咖啡酸在横山老黑豆中含量也相对较高。Bi-Ni Wang等[25]对红枣中的酚酸化合物组成进行了分析，但对黑豆中的酚酸化合物的组成的分析鲜见报道。经NKA-9大孔树脂纯化前后的酚酸的组成及质量分数通过HPLC色谱进行了比较，发现经过大孔树脂吸附横山老黑豆酚酸不会造成单体酚酸组成减少，各种酚酸的质量分数降低也较少。大豆苷和染料木苷是所测的5种异黄酮中质量分数较高的两种成分。NKA-9大孔树脂对所测的5种横山老黑豆异黄酮的分离纯化具有良好的效果，质量分数降低也较少。因此，NKA-9树脂适于分离纯化横山老黑豆酚类物质。