42份云南玉米自交系基于SSR荧光标记的遗传多样性分析

张 鹏，管俊娇，黄清梅，王江民，杨晓洪，刘艳芳，张建华，毛 进

(云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205)

玉米是我国重要谷物，栽培历史已有470多年，根据历年我国玉米的播种面积和产量情况，玉米已成为中国第一大粮食作物[1]。现今全世界约有三分之一人口以玉米作为主要食粮，其中亚洲人的食物组成中玉米占50%，世界范围内对玉米育种及应用研究非常广泛，玉米种质资源也不断推陈出新，就目前我国玉米审定品种数量已多达6000余个[2]。云南地处西南，拥有独特的气候环境，生长季与光热水同季，玉米是云南地区的主要粮食作物[3]，近些年来云南省一直在提倡发展高原特色农业，面对目前玉米品种种质资源的与日俱增，对高原特色玉米遗传种质的来源、系谱关系及遗传差异的分析和掌握程度，是选育优良品种的基础[4]，也是品种管理的需要，同时还能为提高品种质量和价值，避免玉米品种亲缘关系混杂，规范玉米品种市场提供有力的科学理论支撑。

简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)标记是建立在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)基础上的一种目前较为成熟的遗传分子标记，已有效应用于玉米遗传图谱构建、遗传多样性分析、聚类分析和基因鉴定等领域[5-7]，但常规的SSR标记存在工作量大、精度低、分析量小等缺点，已无法满足目前的试验要求。许鲲等通过40对SSR荧光引物构建了我国163份冬油菜指纹图谱[8]。Sanchez-Perez等曾探讨过关于琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管荧光电泳这3种技术各自的优劣，最终得到聚丙烯酰胺凝胶电泳与毛细管电泳比琼脂糖凝胶电泳更具有优势[9]。刘欢等利用荧光检测技术对多花黑麦草进行了EST-SSR指纹图谱的构建，通过研究表明，目前的检测方法都各有优缺点，要根据不同的试验阶段按实际需求选择合适的检测技术[10]。综合3种检测技术，SSR荧光标记技术具有简单易行、精度高、通量大等优点[11-12]，为大数据的分析提供了可能。

因此，本研究采用毛细管荧光标记技术，对收集的42份云南高原地区常用玉米自交系品种遗传多样性进行数据挖掘和系统分析，旨在为高原玉米种质创新、品种遗传改良、评估育种群体遗传多样性等育种工作提供技术支撑[13]，同时也为构建指纹图库，进一步对品种进行规范化管理等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用的42个自交系均为云南常用自交系品种，其中28个为近几年新育成自交系，具体品种信息和品种权授权情况见表1。另外14个为参照自交系，主要为已经公用公知的自交系品种，具体信息和系谱信息见表2。42个自交系品种使用人工气候箱育苗，将需要试验的种子在人工气候箱中进行育苗，设计3个重复，每个重复30株，待幼苗生长到3叶1心时，开始取样，取样从3个重复中分别进行单株取样，共取10个单株进行之后的试验。

表1 新育成自交系信息

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 在玉米苗期，每个品种取5片幼嫩叶片在液氮下混合研磨，采用CTAB法提取DNA。利用紫外分光光度计检测提取DNA质量并用超纯水稀释，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 引物的筛选 根据现行的玉米品种鉴定DNA指纹方法(NY/T 1432─2007)推荐的40对核心引物，通过正交试验设计从中筛选出30对用于本试验，并且扩增条带清晰、重复性好、多态性丰富的引物进行试验，引物相关信息见表3。

1.2.3 PCR扩增 PCR扩增反应体系与现行的玉米品种SSR标准(NY/T 1432─2007)技术参数进行了优化，具体如下：反应体系优为10L，2L缓冲液优化为1L，2L MgCl2优化为0.6L MgCl2或不加，dNTP溶液由1.2L优化为0.8L，Tag DNA聚合酶由0.2L优化为0.25L，检测样品DNA由2L优化为1L。如若不加入MgCl2则以等量的去无菌水代替。

反应采用下列程序：94 ℃预变性5 min，1个循环；30次扩增反应循环(94 ℃变性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。形成的扩增产物于4 ℃下保存。

表2 参照自交系品种系谱信息

1.2.4 荧光标记检测 利用遗传分析仪进行荧光毛细管电泳，并使用DNA Collection Software 软件收集原始数据。引物和荧光标记、Tag DNA聚合酶和dNTP等试剂购自上海生工生物技术有限公司。使用Gene Mapper软件对基因片段进行分析。

1.3 数据分析与统计

试验结果主要进行基因型的数据统计，扩增产物按“0、1、-”进行统计分析，相同位置上，有条带标记为“1”，无条带标记为“0”，数据缺失标记为“-”。数据分析使用NTsys2.11和Excel软件来进行分析统计，并计算遗传相似系数，非加权组平均法(UPGMA,Unweight Pair Group Method Using Arithmetic Averages)进行遗传聚类分析。参照多态性信息量(Polymorphism Information Content)计算PIC值[14]。

2 结果与分析

2.1 云南42份常用玉米自交系SSR标记多态性分析

通过利用30对引物对42份云南常用玉米自交系进行试验，共检测到277个等位基因变异，平均每个位点检测到的等位基因数为9.2个，变化范围4～17个，片段大小介于86～434 bp之间，每个SSR位点的多肽信息量(PIC)在0.7008～0.9979之间，平均为0.9712，其中引物bnlg1191的PIC最大为0.9979，引物umc1335y5的最小，为0.7008，但有的位点(如bnlg1671y17)等位基因数目较多，而PIC值却较低，有的位点等位基因较少，PIC值相对较高(如bnlg490y4)，具体信息见表3。本研究中使用的30对SSR引物均匀分布在全部染色体上，都具有较高的多态性，能够较好地反映出供试材料之间的遗传差异及遗传多样性。图1为掖502、中106、铁7922、JC6181四个品种在引物bnlg1191的扩增带型。

表3 42份云南常用玉米自交系等位基因数和多态信息含量

2.2 云南42份常用玉米自交系遗传多样性分析

通过聚类结果(图1)显示，42个自交系遗传相似系数均大于0.82，具体类群划分不明显，大部分品种遗传相似度较高，说明不同育种单位或育种人在品种选育时所采用的亲本材料遗传基础较狭窄，不同材料分散于不同小类群中，其中F880、NP5203、Y708M为来源不同的相同品种，最终聚到了一起，但遗传相似系数不高，说明这些品种还存在品种内的差异。其中TRL2与C8605-2最为相似，遗传相似系数达到了0.98，主要考虑到引物的原因无法区分，或是因为品种血缘相近的姊妹系。综31、齐318、本7884-7、铁7922和U8112均为美国优良自交系品种，但铁7922和U8112分为一类，其余3个品种为一类。JC6181和中106与其他品种分开，JC181的遗传背景不详，而且没有通过品种授权，中106则属于塘四平头类群，但与其他塘四平头类群的品种，例如黄早4和掖502没有划分为一类，具体原因还有待进一步分析。

图1 4个品种在引物bnlg1191的扩增带型

3 结论与讨论

由于玉米属于异花授粉植物，遗传多样性越高，遗传差异越大，得到高杂种优势的可能性越大。研究玉米品种的遗传多样性是选育优良品种的基础，在玉米种质创新和利用工作中具有重要意义[15-16]。但由于目前大部分的品种都由骨干自交系而来，加上在环境压力和人为选择导致同一单位选育的品种遗传相似度较高，品种遗传多样性不够丰富，云南省丰富资源还没有被完全挖掘利用[17]，导致新育成的玉米品种遗传背景相似、血缘关系相近，不利于品种的创新和种业的发展，因此需要在自交系的有效利用、品种资源评价、共享和交流等方面开展相关工作。

应用SSR标记对42份云南常用玉米自交系的遗传多样性进行分析，通过遗传距离聚类综合分析，可对42份玉米自交系进行类群划分，进一步明确所用种质资源的杂优类群利用方向，为玉米新种质的创制和玉米新品种的选育提供理论依据。