肿瘤免疫治疗时代的NK细胞治疗

2019-10-30邓学文卢进张礼照沼裕

肿瘤预防与治疗 2019年9期

邓学文，卢进，张礼，照沼裕

135-0051 东京，日本生物治疗研究所(邓学文)；610041 成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院肿瘤内科中心(卢进、张礼)；100-0004 东京，东京诊所(照沼裕)

1 肿瘤免疫治疗

手术、化疗和放疗作为肿瘤三大标准治疗方法，在提高肿瘤病人生存率、延长生存时间方面发挥着重要作用。但是，根治肿瘤之路依然任重道远，迫切需要开发新的治疗方法。2013年，美国科学杂志发布肿瘤免疫治疗时代来临[1]。近年来，免疫治疗作为肿瘤第四治疗方法，正在快速发展并受到极大关注。免疫治疗不同于传统标准治疗直接杀伤癌细胞，而是通过激活机体免疫系统来驱除和消灭癌细胞。

目前，免疫治疗包括以CTLA-4和PD-1为代表的免疫检查点抑制剂和免疫细胞治疗。研究CTLA-4的美国人詹姆斯·艾莉森和研究PD-1的日本人本庶佑获得2018年诺贝尔生理学/医学奖，这不仅是对他们研究成绩的肯定，更充分证明了肿瘤免疫治疗的前景和价值。有人把CTLA-4和PD-1在肿瘤治疗领域的成功与抗菌素史上发现青霉素比肩，预示着免疫治疗肿瘤的新纪元。因此，我们可以大胆预测，今后将会出现越来越多利用免疫原理的抗肿瘤药物。免疫细胞治疗包括多种不同细胞类别。目前，美国食品药品管理局已批准了树突状细胞疫苗(Sipuleucel-T)治疗前列腺癌和CAR-T细胞治疗小儿B细胞白血病和淋巴瘤。随着研究的进展，将会开发出更多肿瘤免疫治疗的细胞制剂。

2 自然杀伤(natural killer,NK)细胞

NK细胞是淋巴细胞的一种，发现于二十世纪七十年代中期，因不需要预先致敏直接杀伤癌细胞而命名[2]。NK细胞是自然免疫的重要成分，通过直接攻击应急的、感染的和变质的细胞，对机体保持内环境稳定发挥着重要作用[3-4]。

NK细胞占外周血淋巴细胞的10%～20%[5]，其表现型为CD3-CD14-CD19-CD56+CD16+。目前，一般通过流式细胞仪测定NK细胞(图1)。NK细胞根据CD56分子发现强度和CD16分子表达又可进一步分为功能不同的两个亚型[6-7]。CD56dimCD16+NK细胞占外周血液和脾脏NK细胞的90%，主要以细胞杀伤功能为主，CD56brightCD16dim/-NK细胞主要分布在淋巴结，以产生细胞因子、免疫调节功能为主[6,8]。

图1流式细胞仪测定的外周血NK细胞

从外周血中分离单个核白细胞，用CD3荧光抗体和CD56荧光抗体染色后，BECKMAN COULTER FC500流式细胞仪测定，CYTOMICS CXP软件分析NK细胞及其亚型。横轴为CD3抗体荧光强度，纵轴为CD56抗体荧光强度。在淋巴细胞集团中，CD3阴性CD56阳性细胞集团为NK细胞。NK细胞中CD56荧光表达弱的细胞集团为CD56dimNK细胞亚型；CD56荧光表达强的细胞集团为CD56brightNK细胞亚型。

NK细胞的功能活动取决于NK细胞表面活性化受体和抑制性受体刺激信号的强弱对比，当活性化信号强于抑制性信号时，NK细胞就活性化，反之就处于抑制状态。每个NK细胞表面至少发现有一个抑制性受体，这些抑制性受体主要包括Killer-Ig-Like Receptors(KIRs)和CD94-NKG2A异聚体，它们分别认识细胞表面的组织相容性抗原HLA-Ⅰ和HLA-E，以保护正常细胞不受NK细胞伤害[9-10](图2)。NK细胞通过抑制性受体识别靶细胞，同时，抑制性信号在NK细胞成熟过程中给与其功能训练[11-12]。没有受到抑制性信号刺激的NK细胞是低反应细胞。只有经过自己组织相容性抗原抑制性信号刺激的NK细胞才赋予其功能[13-14]。因此，NK细胞识别癌细胞，病毒感染细胞主要是由于这些细胞的组织相容性抗原MHC-Ⅰ表达减弱或消失(图2)。当然，仅有MHC-Ⅰ表达减弱或消失还不足以活化NK细胞[14]。

NK细胞活性化受体包括NKG2D，以及自然活性受体(natural cytoxicity receptors, NCRs)NKp46，NKp44和NKp30等[15]。当NKG2D与靶细胞表面的糖蛋白MICA、MICB或ULBPs结合，或NCRs与硫酸肝素结合时，就会启动NK细胞内活性信号[16-17]。癌变细胞表面活性化受体表达增强就会激活NK细胞发挥免疫监视效应，使之发现和清除新发生的癌细胞。特别是当癌细胞MHC-Ⅰ表达降低并同时表达活性受体，NK细胞识别癌细胞并活性化，进而释放穿孔素和颗粒酶，启动癌细胞凋亡和杀伤机制[18]。同时，活性化的NK细胞还会释放IFNγ、TNFα等细胞因子，不但协同杀伤癌细胞，还可以活化其它免疫细胞，增强免疫防御能力(图2)。

图2 NK细胞识别正常细胞和癌细胞

上图，正常细胞表达抑制性受体配体MHC-I而无活性受体配体表达，因此，NK细胞功能被抑制，不会杀伤正常细胞。下图，癌细胞抑制性受体配体MHC-I表达消失并且表达活性受体配体，因此，NK细胞活性化，直接杀伤癌细胞，同时释放细胞因子活性化免疫反应。

3 NK细胞与癌症的发生和进展

动物模型研究表明，癌症发生率在缺失NK细胞的鼠比野生鼠更高[19-20]。使用缺失获得性免疫功能的鼠模型证明，NK细胞具有肿瘤免疫监视和免疫编辑作用[21]。日本研究人员Imai等[22]对3625名日本居民随访11年发现，NK细胞活性低的人群比中或高人群患癌风险明显增高。我们对乳腺癌的研究也表明，乳腺癌病人的NK细胞活性明显低于健康人，有转移的乳腺癌病人NK细胞活性进一步降低[23]。胃癌[24]、大肠癌[25]和肾癌[26]等的临床病理研究表明，癌组织中NK细胞浸润的多寡与病人预后有关，NK细胞浸润越多预后越好。因此，NK细胞在癌症的发生和进展中发挥着重要作用。

4 外科手术与NK细胞功能

手术作为实体瘤的主要治疗方法，在肿瘤治疗中发挥着重要作用。但是，肿瘤病人手术后的复发和转移，严重影响病人长期生存的事实不可否认，并早已引起广泛关注[27-28]。Demichi等回顾分析了1 173名接受了手术治疗的乳腺癌病人和250名非手术乳腺癌病人的生存时间，发现手术病人有两个死亡高峰，分别出现在第3年和第8年，而非手术病人只有一个死亡高峰出现在第4年[29-30]。因此，部分病人甚至可能因为手术而加速肿瘤的复发和转移，导致病人生存时间缩短。动物研究表明，手术促进癌细胞转移，降低生存率[31-32]，其原因部分与手术本身有关。近年研究表明，免疫细胞功能障碍与手术后复发转移密切相关[33-34]。

NK细胞作为先天性免疫细胞，在外伤、手术以及危重状态时会出现严重的功能障碍[33,35-36]。NK细胞功能障碍的程度和时间与损伤强度有关。NK细胞功能障碍可以是一过性的，但其生物学影响则可能长期持续，包括对感染和损伤修复的影响[37-38]。研究表明，手术切除实体瘤可能增加肿瘤复发、转移甚至死亡风险[39-40]。早在1913年就已观察到肿瘤手术切除与转移的关系[27]，但是直到近年的研究才发现细胞免疫功能障碍在其中所扮演的角色[33-34]。特别是围手术期NK细胞功能障碍与肿瘤手术后的复发和转移密切相关[33-34]。研究表明，NK细胞功能在手术后第1天已经降低，并与肿瘤的转移程度相关[31]。肿瘤病人复发率也与术后NK细胞功能障碍程度密切相关[41]。因此，在围手术期使用增强免疫功能的细胞因子，如IL-2、GM-CSF、TNFα、IFNα等可以降低手术后肿瘤的复发和转移[42-43]。鉴于这些细胞因子都有增强NK细胞活性的功能，进一步验证了NK细胞在防御肿瘤手术后复发和转移中的作用。

手术后NK细胞功能障碍的机制复杂，涉及手术后血液高凝状态，释放抗炎性反应因子和免疫抑制性细胞增加等[44]。对这些机制的深入研究，将有利于开发肿瘤围手术期免疫治疗的新方法，降低肿瘤手术后的转移和复发，提高肿瘤病人治疗效果和预后。

5 活性化NK细胞治疗

基于NK细胞的肿瘤免疫作用，特别是不受组织相容性抗原和肿瘤抗原限制直接杀伤癌细胞的特性，自然会想到使用NK细胞治疗肿瘤[45-46]。由于外周血中NK细胞数量少，肿瘤病人NK细胞活性降低，因此需要在体外扩增和活性化NK细胞[46]。国际上报道了一些NK细胞活性化培养方法，其中多数需要使用滋养细胞刺激培养，为临床转化应用和监管带来了一些难度[46]。日本开发了一种不使用滋养细胞培养NK细胞的技术，并已做成试剂盒(BINKIT®)在国际上推广使用[47]。BINKIT®操作简单，可以从外周血单个核细胞中直接培养活性化NK细胞，在2至3周内使外周血NK细胞活性化扩增上千倍[48]。BINKIT®培养的NK细胞高表达活性受体，并且细胞因子产生能力比培养前的NK细胞明显提高，对癌细胞的杀伤活性也明显增强[48]。同时，培养NK细胞的细胞杀伤活性明显强于培养γδT细胞和培养αβT细胞[49]。因此，培养NK细胞是非特异性免疫细胞治疗的首选。培养NK细胞静脉注射后可使体内免疫活性化，外周血NK细胞活性增强[47]。使用BINKIT®培养自己NK细胞开展肿瘤免疫细胞治疗，在日本一般是每2至3周治疗1次(图3)，6次为一个疗程。近10年就有超过6万人次以上NK细胞治疗，除偶有发热等不良反应外，没有需要治疗的副作用发生，证明NK细胞治疗的临床安全性。NK细胞治疗通常与树突状细胞治疗，温热治疗和低剂量化疗联合应用，已观察到可以延长进展期胰腺癌的生存时间[50]，以及提高乳腺癌单抗治疗效果等作用[51]。随着治疗案例的累积，NK细胞治疗的效果将会得到进一步发挥和体现。

图3NK细胞治疗流程模式图

一般1次采取30mL～50mL外周血，从中分离单个核白细胞，选择性培养NK细胞。培养时间为2～3周。经过细菌，真菌，支原体和内毒素检测确定安全性后，静脉点滴回输到病人体内。癌症病人治疗时一般1个疗程6次，NK细胞回输前采取下次NK细胞培养的血液。

6 发挥NK细胞治疗作用的方法和策略

鉴于肿瘤病因/病理机制的复杂性，使任何单一肿瘤治疗方法都有其局限性。因此，需要扬长避短，综合治疗。手术是实体瘤的重要治疗方法，特别是对减轻肿瘤负荷具有非常重要的作用[52]。但是，手术本身以及其对机体免疫功能的影响，又可能引起和促进肿瘤的复发和转移[39-40]。特别是围手术期NK细胞功能障碍与术后肿瘤复发/转移密切相关[33-34]，因此，尽量减少手术对机体免疫功能的影响，以及术后尽早提高和恢复免疫功能，包括开展NK细胞等免疫细胞治疗，对于预防和控制复发/转移，提高治疗效果具有积极意义[31-33]。

近年来，分子靶向治疗的迅速发展，为肿瘤病人提供了新的治疗手段和希望[53]。靶向药物包括阻断癌细胞表面信号的抗体和细胞内信号传递的药物。抗体药物不仅可以阻断细胞表面信号传递抑制癌细胞增殖，还可以通过其Fc激活免疫细胞，发挥抗体依存性细胞毒性活性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)[54]。NK细胞表达CD16分子，可以与抗体Fc结合，是重要的ADCC效应细胞[54]。我们以表皮生长因子受体表达阳性的A549肺腺癌细胞株为靶细胞测定培养NK细胞的杀伤活性，即便A549细胞表达抑制性受体配体MHCⅠ，培养NK细胞仍然可以杀伤A549细胞，当同时添加西妥昔单抗时，则显著提高培养NK细胞对A549细胞的杀伤活性(图4)。因此可以期待，当抗体药物与NK细胞治疗联合应用时，可以发挥协同效应。临床上，我们也观察到曲妥珠单抗治疗耐药的乳腺癌病人，当联合NK细胞治疗后，其病情明显改善[51]。另外，阻断癌细胞内信号传递的靶向药物，在抑制癌细胞增殖的同时，也使癌细胞表面NK细胞活性化受体表达增强，有利于NK细胞发挥免疫监视作用[55]。因此，分子靶向药物联合NK细胞治疗有望提高治疗效果，有待今后的临床研究。

图4西妥昔单抗增强培养NK细胞杀伤癌细胞活性

右图，靶细胞A549肺腺癌细胞株表达MHC-I和表皮生长因子受体。左图，横轴为培养NK细胞与靶细胞的比率，纵轴为细胞杀伤活性。用Calcei-AM染色A549后，按一定比率与培养NK细胞共同培养。用TERASCAN VP测定培养前/后的荧光量，根据荧光量的变化计算出细胞杀伤活性。虚线为培养NK细胞单独杀伤A549的活性，实线为培养NK细胞与A549培养时添加西妥昔单抗后的细胞杀伤活性。西妥昔单抗明显增强培养NK细胞对A549的细胞杀伤活性。

肿瘤治疗的重点和难点在于复发和转移。其中上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤转移的重要机制[56]。虽然EMT可以逃逸T细胞免疫[57]，但是其表达NK细胞活性分子，可以致敏NK细胞免疫监视机制[58]。因此，增强NK细胞活性，包括NK细胞治疗，将有助于阻止和预防肿瘤的转移。