海马突触后致密蛋白95在七氟烷抑制小鼠恐惧记忆消退机制中的作用

牛婉秋 康 瑜 唐 玲 于布为 薛庆生

经历极度创伤事件后可导致创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)，PTSD的患病率为5%～10%，在高度暴露的创伤人群中可达20%～30%[1]。临床麻醉也会遭遇与麻醉和手术相关的PTSD，术中意外知晓是医源性PTSD发生的重要因素。临床常用的吸入麻醉药物对于PTSD的影响仍不清楚，PTSD相关记忆改变的发病机制也尚未阐明。PTSD被认为是一种记忆障碍，其中与创伤事件相关的线索形成强大的感觉记忆[2]，因此，情景是恐惧条件反射和恐惧消退的关键因素。研究[3]发现，海马体在情景恐惧记忆中发挥关键作用。突触后致密蛋白95(PSD95)在突触可塑性和学习与记忆中具有重要作用。研究[4]证明，PSD95可以调节突触发育，并在突触稳定和可塑性中发挥重要作用。本研究通过情景条件恐惧实验建立PTSD恐惧记忆的小鼠模型，观察七氟烷对恐惧记忆消退的影响效应，并探讨海马PSD95的表达在该效应中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究获上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物伦理委员会批准。选用36只C57BL/6品系雄性小鼠，7～8周龄，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号为SYXK(沪)2008-0050。兔抗小鼠PSD95抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗小鼠β-actin抗体购自美国Sigma-Aldrich公司，HRP标记的山羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 分组 将小鼠随机分入电刺激+七氟烷组、电刺激对照组和空白对照组，每组12只。

1.3 行为学实验

1.3.1 情景条件恐惧实验 实验方案参考之前PTSD的相关研究[5-6]。应用条件恐惧实验装置(型号为46453，意大利Ugo Basile公司)。将小鼠放入电击箱中适应3 min，随后播放声音作为条件性刺激(CS，90 dB，1 kHz)， 维持60 s， 声音结束前0.5 s对小鼠进行足底电击作为非条件性刺激(US，0.8 mA，0.5 s)，电击后继续停留60 s使CS和US的记忆相偶联，在间隔 1 min后重复进行记忆偶联训练，共进行5次。在训练结束20 min后，电刺激+七氟烷组小鼠给予含体积分数为0.03的七氟烷气体(氧气体积分数为0.3的混合气体)吸入4 h，电刺激对照组小鼠给予不含七氟烷的相同混合气体吸入4 h。由于吸入的七氟烷为麻醉剂量，将小鼠放置在加温毯上保持其正常体温。空白对照组完成同样的训练流程，但不给予CS和US。

1.3.2 恐惧记忆测试 在情景条件恐惧实验结束后第1、2、4和6周进行恐惧记忆测试，测试小鼠的恐惧记忆功能。首先进行情景测试，将小鼠置于箱体内，适应3 min后，记录接下来3 min的僵直时间，继续停留1 min后将小鼠取出。情景测试结束后2 h进行声音测试，将小鼠放入箱体3 min后，播放声音，记录声音刺激时小鼠的僵直时间，声音停止1 min后将小鼠放回鼠笼。

1.4 检测PSD95蛋白质相对表达量 在第6周恐惧记忆测试后，留取3组小鼠的海马组织，采用Western印迹法检测蛋白质含量。用于蛋白质印迹分析的抗体是PSD95(1∶500，Cell Signaling Technology，#3409)和β-actin(1∶5 000，Sigma-Aldrich，A1978)。应用ImageQuant LAS 4000成像系统显影，NIH Image J软件分析条带的吸光度值，计算小鼠海马区PSD95蛋白质相对表达量。

2 结 果

2.1 行为学实验结果 在情景条件恐惧实验结束后第1周的情景测试和声音测试中，电刺激对照组和电刺激+七氟烷组小鼠的僵直时间均显著长于空白对照组(P值均<0.05)，电刺激对照组与电刺激+七氟烷组间的差异无统计学意义(P值均>0.05)。在情景条件恐惧实验结束后第2、4和6周的情景测试和声音测试中，电刺激对照组和电刺激+七氟烷组的僵直时间均显著长于空白对照组(P值均<0.05)，电刺激+七氟烷组的僵直时间又均显著长于电刺激对照组(P值均<0.05)。见表1。

组别时间情景测试声音测试空白对照第1周5.17±0.6510.30±2.19第2周5.30±0.938.37±1.54第4周4.92±0.818.98±1.00第6周4.20±0.629.03±1.62电刺激+七氟烷第1周66.81±8.71①115.00±6.29①第2周52.93±6.00①92.68±12.40①第4周60.28±6.88①105.90±9.03①第6周27.77±3.05①66.43±7.01①电刺激对照第1周53.26±11.93①97.15±7.06①第2周37.92±4.24①②60.92±9.69①②第4周42.30±5.37①②70.85±10.63①②第6周19.11±2.55①②43.38±8.18①②

与空白对照组同时间比较：①P<0.05。与电刺激+七氟烷组同时间比较：②P<0.05

2.2 PSD95蛋白质相对表达量 空白对照组、电刺激+七氟烷组和电刺激对照组的PSD95蛋白质相对表达量分别为0.77±0.02、0.35±0.03、0.61±0.04，电刺激对照组和电刺激+七氟烷组均显著低于空白对照组(P值均<0.05)，电刺激+七氟烷组又显著低于电刺激对照组(P<0.05)。见图1。

1～3 空白对照组 4～6 电刺激+七氟烷组 7～9 电刺激对照组图1 3组小鼠PSD95蛋白质表达电泳图

3 讨 论

本课题组之前的研究发现，丙泊酚能够通过基底外侧杏仁核去甲肾上腺素能系统[7]和海马区调控突触可塑性的γ-氨基丁酸A型受体(GABAA 受体)α5亚单位[8]促进实验动物恐惧记忆的消退，但是对于七氟烷对实验动物恐惧记忆的影响尚不清楚。本研究通过建立小鼠PTSD模型，发现在PTSD伤害性刺激发生后的记忆巩固期吸入七氟烷麻醉4 h，能够抑制PTSD模型小鼠的恐惧记忆消退过程，同时也会抑制PTSD模型小鼠海马区域PSD95的表达。

关于PTSD的建立模型有很多，其中，情景条件恐惧实验是经典的动物模型[9]。PTSD患者的海马区神经功能受到抑制，同时伴随神经元突触可塑性的下调是其病理生理的主要机制。突触可塑性主要包括长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)。突触传递的LTP是研究最多的哺乳动物神经系统中学习和记忆过程的神经生理学模型，并且是应激和记忆相互作用的敏感指标。最近有研究[10]结果表明，行为灵活性与LTD之间存在联系。PSD95作为突触后致密蛋白体，是突触后成分和突触可塑性[11-12]的标志物。相关研究[13-14]结果显示，PSD95的表达下调导致突触结构破坏。本研究结果显示，七氟烷抑制了PTSD小鼠恐惧记忆的消退，并且使PSD95蛋白质相对表达量下降，因此七氟烷可能是通过降低PSD95的表达，从而导致突触可塑性的下调，进而影响恐惧记忆的消退。

本研究为临床实践中经历创伤等不良应激事件的个体更加科学地选择麻醉药物，以减少创伤性记忆对其精神心理的影响提供了相应的实验依据。本研究仍然存在以下不足：①学习记忆相关的脑区相对广泛，本研究仅选择检测海马组织的PSD95，观察范围缺乏全面性和完整性；②没有在造模之前检测3组小鼠的PSD95蛋白质相对表达量；③仅发现了PSD95蛋白质相对表达量与恐惧记忆的相关性，并没有进一步用电生理的指标来检测突触可塑性。

综上所述，七氟烷可以加重PTSD小鼠的恐惧症状，抑制恐惧记忆的消退。这一作用可能是通过七氟烷抑制海马区PSD95的表达来实现的。