8倍稀释血清可有效评估种鸡群沙门氏菌的感染

郭龙宗 李玉燕 丁爱君 崔治中

摘  要：本试验对孵化毛蛋中持续分离到沙门氏菌和间断性分离到沙门氏菌的场区，分别采集种鸡群血清进行沙门氏菌平板凝集试验，将血清样品分为4组：未稀释血清阳性、血清2倍稀释后阳性、血清4倍稀释后阳性和血清8倍稀释后阳性，将这4组血清分别用ELISA B+D群沙门氏菌菌属抗体检测试剂盒进行复核检测。结果显示：这两个场区将血清8倍稀释后平板凝集试验结果和ELISA的检测结果最接近，阳性吻合率分别为97.9%和98.8%。结果显示：将检鸡群血清8倍稀释后进行沙门氏菌平板凝集试验和ELISA B+D群沙门氏菌菌属抗体检测方法具有较高的相关性，可有效评估临床沙门氏菌的野毒感染。

关键词：沙门氏菌;血清8倍稀释;平板凝集

中图分类号：S858.312.5     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2019）09-0006-07

禽沙门氏菌病是由多种沙门氏菌引起的禽类疾病的总称，根据病原体的特征分为三种疾病：鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒。沙门氏菌普遍存在于集约化鸡场，是最重要的卵传细菌性传染病之一[1]。沙门氏菌感染可引起禽类各种急性和慢性疾病，可造成重大的经济损失，各国家在检测和控制该病投入了大量资金[2]。沙门氏菌病是具有重要意义的人畜共患病之一[3]，对医学、兽医学及公共卫生学均具有十分重要的意义。

目前集约化鸡场临床检测沙门氏菌的检测方法主要包括血清学试验、细菌学分离实验以及分子生物学检测方法。血清学实验常用于临床筛检大规模血清样本，主要包括血清平板凝集试验和ELISA试验。申之义[4]等采用平板凝集试验对内蒙古地区鸡沙门氏菌病流行病学进行了调查。沙门氏菌ELISA方法灵敏度高，同样适用于大批样本检测[5]。本研究采用血清平板凝集试验对胶东地区2012～2015年的42批祖代肉种鸡、26批父母代肉种鸡和2011～2015年23批祖代蛋鸡用鸡白痢-伤寒平板凝集试验进行血清学跟踪调查;同时论证了阳性血清8倍稀释后沙门氏菌平板凝集试验与ELISA检测和沙门氏菌病原分离的相关性。汇总统计各批次每周种鸡群未稀释血清和血清8倍稀释后平板凝集试验检测的阳性率，按照鸡群年度批次进行统计分析，用于评估沙门氏菌各项措施的控制效果。

1  材料与方法

1.1  试剂  B群和D群沙门氏菌属抗体检测试剂盒，购自BioChek公司;鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原，购自北京中海生物科技有限公司。

1.2  样品的采集与处理  选取胶东地区2012～2015年的42批祖代肉种鸡、26批父母代肉种鸡和2011～2015年23批祖代蛋鸡用鸡白痢-伤寒平板凝集试验进行血清学跟踪调查，分别在16、19、21、24、26、28、30、32、34、36、39、42、46、48、50、52、55、58、61、65周采集血清进行平板凝集试验，每场采集的血清量为鸡群饲养量的1%，对平板凝集阳性的血清用生理盐水做8倍稀释，后再用鸡白痢-伤寒平板凝集试验进行复检，计算统计每周的阳性率和血清8倍稀释后检测的阳性率，并按照鸡群年度批次进行统计分析，用于评估各项措施的控制效果。

1.3  沙门氏菌平板凝集试验方法  分别吸取30 μL的阳性血清、阴性血清和待检血清，滴于清洁玻璃板上，随后滴加同量的凝集试验抗原，用枪头弯折面使血清与抗原均匀混合，涂布成直径为1～2cm的液面，不断轻轻摇动玻璃板，2min后即可观察结果。

1.4  用ELISA方法测定血清中沙门氏菌B+D群菌属抗体的试验方法  对连续4个月在种鸡和种蛋孵化啄壳死亡毛蛋中持续分离到沙门氏菌的3个对应种鸡群采集血清，进行沙门氏菌平板凝集试验，将血清样品分为4组：未稀释血清平板凝集试验阳性、血清2倍稀释后阳性、血清4倍稀释后阳性和血清8倍稀释后阳性，将4组血清分别用ELISA B+D群沙门氏菌菌属抗体检测试剂盒进行检测。同样采集在4个月中间断性在孵化毛蛋中分离到沙门氏菌的鸡场种鸡血清，一共3个种鸡场，按照同样方法对血清进行稀释，对不同稀释度的阳性血清用BIOCHEK沙门氏菌B+D群菌属ELISA抗体试剂盒进行检测，检测方法参照ELISA试剂盒操作说明进行。

采集5个沙门氏菌分离阴性场的血清进行鸡白痢-伤寒平板凝集试验检测，对317份凝集试验阳性的血清用ELISA方法进行复核检测。同时选取一个肉种鸡病原学阳性场（父18场）和一个病原学阴性场（父17场），采集血清进行鸡白痢-伤寒平板凝集试验检测，并对阳性血清8倍稀释后再用平板凝集试验进行复检，汇总分析试验结果。

2  结果

2.1  2012～2015年度不同种鸡群的平板凝集试验和8倍稀释平板凝集试验结果分析  采集胶东地区2012～2015年的42个祖代肉种鸡批次、26批父母代肉种鸡和2011～2015年23個祖代蛋鸡批次的血清，用鸡白痢-伤寒平板凝集试验进行检测，合计检测血清 330660份。其中，42批祖代肉种鸡在不同周龄的平均平板凝集阳性率，在19周时阳性率最高，达21.3%;在58周阳性率最低，为10.3%，见图1;从年度比较可以发现，2012年度整体趋势最高，2014年度鸡群在30周之前较低，32周之后与2013年呈交叉趋势，2015年度鸡群平板凝集阳性率最低，30周之后的产蛋期的阳性率都在15%以下，只有在产蛋最后期的65周上升至18.8%，见图2。

将各年度各批次的血清8倍稀释后平板凝集试验阳性率结果显示：2013～2015年度批次的下降是明显的（2012年度未采用血清稀释的方法，缺少该年度数据），特别是2015年度批次30～52周龄阳性率为0%，但55周后有上升趋势，见图3。

父母代场血清8倍稀释后的平板凝集阳性率2015年与2013～2014年度鸡群相比，下降明显，见图4;特别是2013～2014年度祖代肉种鸡群46周血清稀释阳性率要高于2%，而2015年的阳性率则低于1%。

23批祖代蛋种鸡未稀释血清平均平板凝集阳性率在19周最高，高达7.52%，这一周龄与肉种鸡相同，其他周龄的阳性率均低于8%，见图5。整个饲养周期的阳性率对比：蛋种鸡明显低于肉种鸡，肉种鸡阳性率普遍在10%～20%之间，见图1、图5。不同年度鸡群平均未稀释血清平板凝集阳性率的比较：2015年度批次阳性率最低，均低于 3.5%，并且多个周龄连续监测为阴性，见图6，因蛋种鸡前期未使用血清稀释的方法检测，同时后期稀释后极少出现阳性，故未采用血清稀释的方法进行比较。

2.2  8倍稀释平板凝集阳性血清与ELISA检测、临床相关性  对孵化毛蛋中持续分离到沙门氏菌和间断性分离到沙门氏菌的三个场区，分别采集种鸡群血清进行沙门氏菌平板凝集试验，对结果阳性的血清进行2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释后同时用鸡白痢-伤寒平板凝集试验和ELISA B+D群沙门氏菌菌属抗体检测试剂盒进行检测。试验结果的相关性比较分析见表1、表2。在孵化毛蛋中持续分离到沙门氏菌的場区，将阳性血清8倍稀释后平板凝集试验仍呈阳性的结果和ELISA的检测结果最接近，阳性吻合率达97.9%;在毛蛋中间断性分离到沙门氏菌的场区，将阳性血清8倍稀释后平板凝集试验仍呈阳性的结果和ELISA检测阳性吻合率可达98.8%。结果显示这两种方法具有较高的相关性，而未稀释血清和2倍稀释血清的平板凝集试验结果与ELISA检测结果差距明显。其中血清未稀释组持续分离到病原场的血清吻合率为62.5%，而间断性分离场的则为7.7%。

采集5个沙门氏菌分离阴性场未稀释的血清进行鸡白痢-伤寒平板凝集试验检测，对317份凝集试验阳性的血清用ELISA方法进行复核检测，结果只有1份阳性。这说明未稀释血清的平板凝集试验假阳性率非常高。同时选取一个肉种鸡病原学阳性场（父18场）和一个病原学阴性场（父17场），采集血清进行鸡白痢-伤寒平板凝集试验检测，并对阳性血清8倍稀释后再用平板凝集试验进行复检，结果显示：这两个场未稀释血清的平板凝集试验结果的阳性率有差异，见图7。

从图7可知，父母代18场阳性率持续高于父母代17场，但同时阴性场（父17）未稀释血清也存在持续的平板凝集阳性结果;而将血清8倍稀释后进行沙门氏菌平板凝集试验，仅在父母代18场检测结果阳性，而阴性场（父17）平板凝集试验检测均为阴性，符合沙门氏菌感染的真实状态。这也证明：将血清8倍稀释后进行鸡白痢-伤寒平板凝集试验更有利于排除假阳性的干扰，可有效评估鸡群是否受到沙门氏菌野毒感染，便于养殖场采取对应的防控措施。

3  讨论

3.1  种鸡群平板凝集阳性率对鸡群净化的评估

对不同年度种鸡群未稀释血清连续鸡白痢-伤寒平板凝集检测发现，平板凝集阳性率呈逐渐下降趋势，但在2015年度沙门氏菌分离为阴性的祖代肉、蛋种鸡群，未稀释血清平板凝集检测仍存在一定的阳性率。整个产蛋周期内连续对未稀释血清平板凝集阳性的鸡只进行沙门氏菌病原分离，并未分离到沙门氏菌，但平板凝集试验却呈现波动的阳性，这说明未稀释血清平板凝集试验存在假阳性。假阳性率的高度变化，蛋鸡、肉种鸡检测的结果并不一致，肉种鸡要高于蛋种鸡，说明平板凝集阳性率存在多种因素的干扰。许多细菌与鸡白痢沙门氏菌具有共同抗原或抗原性极为密切，这些细菌可感染禽类，并产生凝集素应答。已发现大肠杆菌、微球菌和链球菌（尤其是兰氏D群的链球菌）感染构成了鸡的非白痢阳性反应的大部分。其他细菌所致的感染如表皮葡萄球菌、微球菌、产气杆菌、变形杆菌、大肠杆菌及某些种的亚利桑那菌、普罗维登氏菌和枸橼酸菌，与许多非白痢阳性反应有关。其他沙门氏菌特别是D群的细菌如肠炎沙门氏菌，同样可产生交叉反应，禽群中非白痢阳性者可从少数几只到30%～40%的数量，凝集反应特性变化不一[1]。我们检测到的平板凝集试验阳性菌就是肠炎沙门氏菌引起的平板凝集阳性，而非白痢。在平板凝集阳性鸡只我们分离到过类弗氏柠檬杆菌，其培养和单因子凝集结果接近沙门氏菌，是造成假阳性的原因之一。对有代表性的阳性反应鸡只进行一系列的细菌学检查，通常才是确定鸡群是否感染沙门氏菌以及感染哪种沙门氏菌。通过病原阴性场平板凝集阳性率的曲线发现，平板凝集阳性率与油苗的免疫有一定的关联性，特别鼻炎和支原体等油苗的免疫更会刺激产生假阳性;血清冻融、血脂含量、反应温度、不同人的主观判定都会影响平板凝集试验结果。

3.2  血清8倍稀释方法对鸡群感染状况的评估可行性  因实际生产中鸡群免疫、其他细菌感染等复杂的环境，鸡群鸡白痢-伤寒平板凝集试验受到多重因素的干扰，容易出现假阳性的问题。细菌分离在某些企业还未开展，大多数养殖场实验室都能熟练操作ELISA方法，但其检测费用太高，不适合临床鸡群的日常监控与净化。生产中高代次鸡群的重点是净化，而低代次解决的是判定感染状况与降低对生产的影响为最终目的。因此，我们采用了血清8倍稀释后进行平板凝集的方法，并用ELISA B+D群沙门氏菌属检测试剂盒进行复核，发现血清8倍稀释后阳性与ELISA检测数据之间具有较强的对应性;其次也发现若鸡群鸡白痢-伤寒平板凝集试验阳性率快速上升，同时血清8倍稀释后检测仍为阳性时，临床产蛋孵化雏鸡的投诉率也会有快速上升的趋势。因此，血清8倍稀释后鸡白痢-伤寒沙门氏菌平板凝集阳性率可有效评估临床沙门氏菌野毒感染的状态，并为沙门氏菌的临床用药和净化控制奠定基础。

参考文献：

[1]  刘金华，甘孟候.中国禽病学（第二版）[M].北京：中国农业出版社，2015：190-205.

[2]  Saif  Y  M.禽病学（第十二版）[M].北京：中国农业出版社，2012：723-780.

[3]  陸承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社， 2001.

[4]  申之义，李利萍，张庆华，等.内蒙古地区鸡沙门氏菌病流行病学调查[J].中国兽医杂志，2001，37（9）：22-23.

[5]  况慧星，韦婷.禽沙门氏菌的检测与防制[J].中国家禽，2003，25（4）：1-4.

Wild Virus Infection of Clinical Salmonella can be effectively evaluated by Salmonella plate agglutination test after 8-fold dilution of chicken serum

GUO Longzong1， LI Yuyan1 ，DING Aijun1 ，Cui Zhizhong2*

（1.Shandong Yisheng Animal and Poultry Breeding Company，Yantai 264680，China;

2.Shandong Agricultural University，Taian 271000，China）

Abstract：Salmonella was continuously isolated from hatched eggs and intermittently isolated to Salmonella fields.Serum samples of chicken flocks were collected for Salmonella plate agglutination test. Serum samples were divided into four groups：undiluted serum positive，serum positive after 2 times dilution，serum positive after 4 times dilution and serum positive after 8 times dilution.The four groups of sera were detected by ELISA B + D group Salmonella antibody detection kit.The results of plate agglutination test after 8 times dilution of serum were the closest to result of ELISA.The positive coincidence rates were 97.9% and 98.8% respectively.The results showed that Salmonella plate agglutination test and ELISA B + D group Salmonella antibody detection method had high correlation after 8 times dilution of chicken serum，which could effectively evaluate clinical Salmonella wild virus infection.

Key Words：Salmonella; Serum 8-fold dilution; Plate agglutination; ELISA□