鱼类Foxl3基因的生物信息学分析

姚竞杰 申祥 徐萍 徐小博 王三虎

摘 要：为进一步探明Foxl3的结构、功能信息，及其在鱼类性别决定和分化中的作用，利用生物信息学方法对欧洲黑鲈、青鳉、斑马鱼和虹鳟的Foxl3蛋白进行同源性、蛋白质理化性质、二级结构、功能结构域和三级结构分析。结果表明：欧洲黑鲈与青鳉、斑马鱼同源性较高，和虹鳟相似度不高，只有79%;鱼类的Foxl3蛋白分别编码269、264、260和296个氨基酸;该蛋白定位于细胞核，无明显信号肽和跨膜结构;主要的二级结构元件是α-螺旋和无规则卷曲，且α-螺旋所占百分比：虹鳟>青鳉>欧洲黑鲈>斑马鱼，无规则卷曲所占百分比：欧洲黑鲈>虹鳟>青鳉>斑马鱼;均包含1个Forkhead家族（FH superfamily）功能结构域。

关键词：Foxl3;鱼类;性别决定与分化;生物信息学

中图分类号 Q344文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）17-0016-03

鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性，且存在雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型，性逆转在鱼类中也是常见的现象。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，关于鱼类的性别决定和分化相关基因的研究越来越多，主要基因有Sox9、Dmrt1、Dax1、Wt1、Sf1、Amh、Tra2、Foxl2和芳香化酶基因[1-2]。

Foxl2（Winged helix/forkhead transcription factor gene）属于叉头转录因子家族，是目前发现的脊椎动物卵巢决定和分化的最早的标志性启动基因，它可以调节卵巢芳香化酶，对卵巢的分化起到重要作用。目前关于鱼类Foxl2的研究，已经在罗非鱼[3]、石斑鱼[4]、胡子鲶[5]、稀有鮈鲫[6]、乌鳢[7]、舌齿鲈、青鳉[8]、斑马鱼[9]、虹鳟[10]、牙鲆[11]和黄鳝[12]等展开。研究中发现Foxl2广泛表达于脑、垂体、鳃和性腺中，主要作用机制为：激活CYP19a的表达和抑制精巢特异基因的表达，如Sox9、Dmrt1。

Forkhead基因家族进化分析表明，Foxl2在许多硬骨鱼类中存在不同的拷贝，即Foxl2存在旁系同源基因，分别命名为Foxl2a（Foxl2）和Foxl2b（Foxl3），它们在不同的硬骨鱼类中被描述，并被认为是鱼类特异性存在。根据基因组进化分析，真兽亚纲动物在进化过程中失去了Foxl3拷贝[13，14]，Foxl2已有很多研究且与卵巢的发育相关，那么Foxl3在低等脊椎动物中的功能，尤其是与性别分化相关的功能需要深入研究[13]。

1 材料与方法

通过NCBI数据库获得欧洲黑鲈（Dicentrarchus labrax）、青鳉（Kryptolebias marmoratus）、斑马鱼（Danio rerio）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的foxl3蛋白序列，采用BLAST功能比对分析4种鱼的foxl3蛋白序列同源性，利用Protparam程序对4种鱼foxl3蛋白序列的氨基酸进行分析，应用PSORTⅡ进行亚细胞定位分析，利用SOPMA和SWISS对foxl3蛋白氨基酸序列二级结构和三级结构进行预测分析，通过TargetP 1.1和TMHMM Server v.2.0在线分析蛋白序列跨膜区域，采用NCBI中的CDD数据库预测蛋白功能结构域。

2 结果与分析

2.1 序列来源及同源性 目前为止，GenBank中仅有欧洲黑鲈（Dicentrarchus labrax）、青鳉（Kryptolebias marmoratus）、斑馬鱼（Danio rerio）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的foxl3蛋白序列。GenBank登录号分别为：欧洲黑鲈：AFV13295，青鳉：APD78564，斑马鱼：AAI62838和虹鳟：NP_001117956。通过NCBI的BLAST功能比对分析4种鱼的foxl3蛋白序列，结果显示（图1），欧洲黑鲈foxl3蛋白氨基酸序列与青鳉相似度100%，与虹鳟foxl3蛋白氨基酸序列相似度99%，相似度非常高;而与斑马鱼foxl3蛋白氨基酸序列相似度79%，相似度不是很高。

序列同源性分析

2.2 蛋白质结构

2.2.1 蛋白质理化性质分析 利用Protparam程序对4种鱼foxl3蛋白序列的氨基酸组成、等电点、正负电荷残基数、摩尔消光系数等进行在线分析。亚细胞定位应用PSORTⅡ进行分析，结果如表1所示。由表1可见，欧洲黑鲈foxl3蛋白编码269个氨基酸，相对分子质量为29.925，理论等电点8.48，亚细胞定位于细胞核;青鳉foxl3蛋白编码264个氨基酸，相对分子质量为29.457，理论等电点7.71，亚细胞定位于细胞核;斑马鱼foxl3蛋白编码260个氨基酸，相对分子质量为29.306，理论等电点8.4，亚细胞定位于细胞核;虹鳟foxl3蛋白编码296个氨基酸，相对分子质量为33.221，理论等电点8.46，亚细胞定位于细胞核。4种鱼foxl3蛋白均定位于细胞核内，最有可能具有转录和转录调控的功能，这与foxl2蛋白功能相近。

2.2.2 二级结构 利用SOPMA对4种鱼foxl3蛋白氨基酸序列二级结构进行预测分析，结果显示，4种鱼foxl3蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。欧洲黑鲈foxl3蛋白由15.99%α-螺旋，5.58%β-转角，9.67%延伸链和68.77%无规则卷曲组成。青鳉foxl3蛋白由18.18%α-螺旋，6.44% β-转角，11.74%延伸链和63.64%无规则卷曲组成。斑马鱼foxl3蛋白由15.77%α-螺旋，7.31%β-转角，13.85%延伸链和63.08%无规则卷曲组成。虹鳟foxl3蛋白由20.27%α-螺旋，3.72%β-转角，8.78%延伸链和67.23%无规则卷曲组成;4种氨基酸序列结构基本一致（图2）。

2.2.3 功能結构域 4种鱼的foxl3蛋白功能结构域采用NCBI中的CDD数据库预测，结果显示，欧洲黑鲈foxl3蛋白在第38～123个氨基酸区域、青鳉foxl3蛋白在第39～124个氨基酸区域、斑马鱼foxl3蛋白在第35～120个氨基酸区域和虹鳟foxl3蛋白在第54～139个氨基酸区域均为Forkhead家族（FH superfamily）结构域（图3）。

2.2.4 三维结构及其功能预测 利用SWISS-MODLE软件构建4种鱼foxl3蛋白三维结构模型，结果如图4所示。由图4可见，欧洲黑鲈、青鳉和斑马鱼的三维结构基本一致，仅虹鳟的三维结构与前3种鱼存在细微的差异。三级结构决定了蛋白的性质，所以foxl3蛋白在4种鱼性别分化过程中起作用。

3 讨论

鱼类性别分化不仅受遗传因素控制，还受环境的影响，是多种因素综合作用的结果。雌激素在硬骨鱼卵巢分化中起决定性诱导作用，是卵巢分化的天然诱导剂，一旦性腺中有雌激素合成，无论其遗传性别如何，都将发育为卵巢。青鳉性别决定基因的研究表明，通过抑制雌激素的合成或调控雌激素合成信号通路因子的表达来实现性别控制，亦可通过基因敲除实现性别逆转。此外，多年来虽然在鱼类克隆得到了很多哺乳动物性别决定的同源基因，但这些基因在鱼类性别决定与分化中的真正功能和作用尚待深入研究。同时，由于硬骨鱼类性别决定机制的多样性和复杂性，性别决定的分子机制总体尚不清楚。

本研究通过对Genbank数据库中现有的Foxl3蛋白氨基酸序列（欧洲黑鲈、青鳉、斑马鱼和虹鳟）进行了生物信息学分析，发现4种鱼Foxl3蛋白氨基酸序列之间相似度较高;且蛋白均定位于细胞核内，无跨膜结构、信号肽和磷酸化位点;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，含有1个Forkhead家族结构域。

参考文献

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（責编：杨 林）