独活寄生汤对改良Hulth法造模大鼠膝骨关节炎软骨形态的影响

赵忠胜 ，黄云梅 ，郑若曦 ，邱建清 ，刘淑如 ，吴广文

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）多见于中老年人，是最常见的骨关节炎类型。随着人口老龄化及肥胖人口增加，其发病率逐年增加［1-2］。膝骨关节炎易反复发作，缠绵难愈，具有较高的致残率。KOA以软骨退变、滑膜炎症、骨赘形成、软骨下骨硬化等为主要病理特征［3］，其确切病因及发病机制尚不明确。目前的治疗方法以对症治疗为主，仍未找到能够延缓KOA进展的有效方法［4］。早期进行干预预防可延缓关节软骨退变、修复软骨损坏，对防治KOA的进一步发展有重要意义［5-6］。独活寄生汤作为中药复方，具有扶正祛邪、标本兼顾的特点，能有效缓解KOA患者的临床症状。研究表明：独活寄生汤能抑制软骨细胞凋亡，延缓软骨退变，但其效应的作用机制有待深入研究［7-8］。本研究观察独活寄生汤对改良Hulth法造模大鼠膝骨关节炎软骨形态的影响，从形态学角度探讨其作用机制，为其临床运用提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级2月龄雄性SD大鼠66只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司［合格证号：SCXK（沪）2017-0005］提供。动物处理方法符合中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 实验药物 独活寄生汤药物组成：独活9 g，桑寄生 6 g，牛膝 6 g，杜仲 6 g，秦艽 6 g，防风 6 g，肉桂 6 g，细辛 6 g，当归 6 g，川芎 6 g，熟地黄 6 g，芍药 6 g，人参 6 g，茯苓 6 g，甘草 6 g；盐酸氨基葡萄糖胶囊（香港澳美制药厂）；均购于福州市闽侯县上街致诚医药商店。

1.3 实验药液制备 独活寄生汤药液按照大鼠数量、体质量，计算出用药量，加入蒸馏水煎煮的药液，浓缩至浓度为0.93 g／mL，-20℃保存备用。盐酸氨基葡萄糖胶囊用蒸馏水配制，浓度为0.15 g／mL，4℃冰箱保存备用。

1.4 实验仪器与试剂 BioSpec 70／20 USR小动物核磁共振成像仪（瑞士布鲁克公司）；RM2265石蜡切片机、DM4000B研究级生物显微镜（德国徕卡仪器公司）；Moticam5000c＋Motic M形态学显微图像采集与分析系统（厦门市麦克奥迪实业集团有限公司）；改良番红O-固绿软骨染色液（北京Solarbio生物技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模 大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为正常组18只和造模组48只。采用改良Hulth法造模：大鼠膝关节内侧入路，切断内侧副韧带、前交叉韧带，摘除内侧半月板［9］。术后连续3 d肌肉注射青霉素20万U预防感染。手术伤口愈合后开始每天强迫大鼠活动0.5 h，连续2周。

2.2 大鼠膝关节MRI扫描 大鼠造模强迫运动2周后，随机抽取正常组、造模组大鼠各3只，拍摄膝关节MRI，观察膝骨关节炎进展情况。采用气体（异氟烷与氧气混合，比例1∶4）麻醉装置对大鼠进行持续麻醉，扫描过程中实时监测大鼠生命体征。将大鼠仰卧位固定于检查板，膝伸直辅以软垫固定，环形表面线圈固定于关节正上方，线圈中心正对胫骨平台，采用冠状位和矢状面T2WI序列进行成像。T2WI序列采用TurboRARE序列，参数如下：TR＝4 554.863 ms，TE＝35.0 ms，层厚 0.4 mm，矩阵 256×256，FOV 30×20 mm2，扫面层数 13 层，平均次数4 次，扫描时间 9 min、43 s、22 ms。

2.3 干预 造模结束后，抽签法将造模组随机分为3组，即模型组、对照组和治疗组各15只。根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算［10］，灌胃给药12周，2周1个疗程，每个疗程间隔2 d。正常组和模型组按 10 mL／（kg·d）给予 0.9%NaCl溶液灌胃；对照组按 0.15 g／（kg·d）给予盐酸氨基葡萄糖胶囊灌胃；治疗组按 0.93 g／（kg·d）给予独活寄生汤灌胃。

2.4 取材 灌胃结束后，采用2%戊巴比妥钠溶液按2 mL／kg的剂量麻醉大鼠，切取左侧胫骨平台内侧软骨组织。标本置于4%多聚甲醛中固定48 h后，用10%EDTA-2Na脱钙液中脱钙8周，每3天换1次脱钙液。组织标本修切后，常规石蜡包埋。

2.5 软骨组织HE染色与Mankin评分 组织切片常规脱蜡至水后，苏木素染色10 min，蒸馏水漂洗1 min，1%盐酸酒精分色3 s，自来水洗，返蓝15 min；伊红染色3 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥，封片，显微镜下观察软骨组织形态结构。各组软骨组织HE染色后，每张切片选取5个不同视野，参照Mankin关节软骨病理评分标准［11］，从软骨结构、软骨细胞状态、基质染色、潮线的完整性等方面进行评分。

2.6 番红O-固绿染色与OARSI评分 组织切片常规脱蜡至水后，在新配制Weigert染色液（A1∶A2＝1∶1）中浸染 5 min，酸性分化液分化 15 s，蒸馏水洗10 min，固绿染色液内浸染5 min，快速用弱酸溶液洗涤15 s以去除残留固绿，番红O染色液浸染7 min，分别用95%、100%酒精脱水，二甲苯透明，干燥，封片，镜下观察软骨组织形态结构。番红O-固绿染色后，每张切片选取5个不同视野，参照OARSI关节病理评分标准［12］，从蛋白多糖丢失、软骨丢失、纵裂或糜烂、病变到达钙化软骨等方面进行评分。

2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（）表示，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布以中位值（第一四分位数，第三四分位数）表示，组间比较采用秩和检验。

3 结 果

3.1 实验动物死亡情况 在实验过程中，模型组因麻醉意外致死1只，灌胃过程因肺栓塞致死1只；治疗组灌胃过程因腹泻致死1只；对照组灌胃过程因肺栓塞致死1只。最终共56只进入结果分析。

3.2 大鼠膝关节MRI 正常组可见关节间隙正常，内外侧半月板结构完整，股骨髁和胫骨平台关节面平整。造模组关节间隙增宽，内侧半月板缺如，关节软骨面不平整、软骨层变薄、局部缺损，结缔组织增生，骨赘形成，关节肿胀积液明显。见图1。

图1 大鼠膝关节MRI影像图

3.3 关节软骨HE染色 正常组关节软骨表面平整，四层结构清晰，无裂隙或中断，细胞排列整齐，基质染色均匀，潮线完整。模型组软骨表面粗糙、碎裂或缺失，裂隙深达辐射层，软骨细胞排列混乱，基质染色不均匀，潮线破坏，软骨下骨增生明显。对照组关节软骨表面不规整，软骨层变薄，局部有表浅裂隙，软骨细胞部分缺失，局部细胞增生，基质染色不均匀，潮线尚完整，软骨下骨结构紊乱。治疗组关节软骨表面不规则，层次完整，软骨细胞弥漫性增生，排列轻度紊乱，潮线完整，软骨下骨无明显改变。见图2。

3.4 关节软骨番红O-固绿染色 番红O是碱性染料，与硫酸软骨素、硫酸角质素等酸性蛋白多糖结合，将软骨基质染成红色；固绿是酸性染料，与富含碱性氨基酸的胶原纤维结合，将软骨浅表层、软骨下骨染成绿色。正常组可见软骨基质红染，颜色鲜艳，固绿将浅表层、软骨下骨染成绿色。模型组番红O染色中重度减弱，部分失染；局部地方细胞增生、肥大，细胞数量增多。对照组和治疗组经干预后，均较模型组改善，番红O染色增强，染色变深，表明治疗后蛋白多糖表达上升，治疗组较对照组改善更明显，染色更深，说明治疗组疗效优于对照组。见图3。

图2 关节软骨HE染色图（×100）

图3 关节软骨番红O-固绿染色图（×100）

3.5 4组软骨组织Mankin评分、OARSI评分比较见表1。

表1 4组软骨组织Mankin评分、OARSI评分比较（） 分

表1 4组软骨组织Mankin评分、OARSI评分比较（） 分

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01；与对照组比较，3） P＜0.01。

组别正常组模型组对照组治疗组n 15 13 14 14 Mankin评分0.33（0.00，0.83）11.28±1.271）8.92±1.682）6.58±1.562）3）OARSI评分0.33（0.00，0.83）5.27±0.791）4.58±0.792）3.00±0.852）3）

4 讨 论

骨性关节炎发病机制非常复杂，是众多因素相互作用的结果。KOA发生发展不仅是关节软骨基质分解与合成代谢的失衡，还是全身衰老性改变的局部反应［10］。 软骨的退变是 KOA 的基本病变［13-14］，软骨表面的胶原纤维退化，使软骨负荷面变薄，粗糙不平，软骨的深层发生裂隙。关节受力异常，关节软骨磨损刺激关节滑膜和软骨细胞出现炎症反应，继发滑膜组织增生、关节积液和软骨营养障碍［10，13］。磨损导致局部软骨消失和外围软骨的增生，骨赘形成，加重关节畸形和破坏，导致软骨下骨外露、硬化、囊变及关节间隙的变窄［15-16］。模型的选择与建立是研究KOA病理机制及防治的必要手段，诱发动物KOA模型可通过关节机械制动、手术改变关节应力、破坏关节局部血液循环、药物关节腔内注射等多种方法。本实验采用与DMM造模法类似的改良Hulth 法造模［9，17］，一方面，膝关节内翻，力学轴线改变，负重力线内移，关节面缓冲力较低，形成应力集中而继发骨小梁微骨折、骨质塌陷；另一方面，膝关节稳定性降低，胫股关节面软骨磨损，引起软骨退变；加之造模后，强迫大鼠运动，加速KOA形成。

大鼠造模1个月后膝关节MRI显示：关节软骨变薄、缺损，关节腔内积液，表明经改良Hulth法造模后，大鼠膝关节已向骨关节炎发展，出现骨关节炎的早期病理表现。干预后HE染色、番红O－固绿染色结果显示，模型组软骨退变、破坏等；正常组Mankin评分明显低于模型组，表明改良Hulth法造模4个月后，大鼠膝关节已出现骨关节炎的中晚期病理表现。综合对比正常组与模型组实验结果，表明改良Hulth法是诱发大鼠KOA理想的造模方法，与KOA发病机制相符，贴近临床实际，是一种理想合理的造模方法。

膝骨关节炎属“痹痛”“骨痹”范畴，以虚为本，以痰、瘀之实为标，属本虚标实、本痿标痹之证［18］。KOA的治疗以控制疼痛、延缓软骨退变、改善关节功能为目标。早期KOA以保守治疗为主，旨在延缓病情进展；中晚期KOA以手术治疗为主，配合保守治疗，旨在缓解疼痛，改善关节功能，提高生活质量。对于早期KOA的治疗，中医药有良好的临床疗效。独活寄生汤具有补肝肾、益气血、祛风湿、止痹痛之效。现代药理学、临床应用研究表明，独活寄生汤具有抗炎镇痛、改善微循环、延缓软骨退变等作用［5，19-20］，广泛应用于骨性关节炎、腰椎间盘突出症等骨科疾病。关于其治疗KOA的机制，仍在进一步探索之中。

本研究在应用改良Hulth法诱发大鼠KOA模型的基础上，观察独活寄生汤对KOA大鼠关节软骨形态的影响，从形态学角度探究独活寄生汤治疗KOA的机制。治疗结束后，模型组取材后肉眼观察示：关节周围滑膜、韧带等结缔组织增生明显，关节间隙变窄，软骨被大量增生组织包裹，软骨表面苍白不平整；形态学染色示：浅表层毛糙，局部缺损，软骨细胞增生、肥大，细胞数量增多，软骨下骨结构紊乱、增生，说明改良Hulth法造模后，大鼠膝关节软骨及软骨下结构病变严重，病变累及软骨层及软骨下骨。治疗组取材后肉眼观察示：关节周围滑膜、韧带等结缔组织增生较轻，软骨表面有血色、较平滑；形态学染色示：软骨表面较平滑，软骨细胞数量增多，排列较规则、整齐，软骨基质中蛋白多糖含量增加。治疗组病理变化明显较模型组轻，说明独活寄生汤在一定程度上可以抑制软骨退变，以维持软骨结构的完整性；促进软骨细胞及基质分解与合成代谢，以促进软骨细胞增殖，增强软骨修复功能，从而有效抑制KOA的进展。