4种化感物质对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数影响的比较

2019-10-25甘小蓉杨超慧

四川环境 2019年5期

甘小蓉，王超，杨超慧

(1. 河海大学浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室，南京 210098；2. 河海大学环境学院，南京 210098)

1 前言

水华一直是当代水环境污染问题中比较重要且突出的一项，其中隶属蓝藻门的铜绿微囊藻是造成水华现象的罪魁祸首之一。铜绿微囊藻能够产生毒性很强的微囊藻毒素，藻毒素在水体中扩散会影响自然水体生态功能，进而危害人体健康和影响社会稳定。

为了解决水体富营养化这一问题，上个世纪八十年代开始到今天国内外学者已经做了大量的研究，得出的控藻抑藻的方法主要有物理法、化学法和生物法等[1～5]；除此之外，超声波除藻技术也得到了相应的研究与发展，但是其存在较大的安全隐患，可能会对周围水生动、植物造成不利的影响[6～8]。近年来，水生植物分泌的次生代谢物质对藻类的化感抑制作用逐渐成为了领域内的研究热点。

大量的现场试验以及实验室研究均表明水生植物可以分泌和释放一些化学物质对引起水华的藻类产生抑制效应，从而控制蓝藻水华的产生[9-10]。而化感物质作为植物次生代谢物质，自然环境下可降解，在生态系统中不易积累，生态安全性较好[11]。鲁志营等[12]研究化感抑藻的机理，发现化感物质是通过破坏细胞膜结构、影响藻细胞内叶绿素合成从而破坏光合系统Ⅱ(PSⅡ)、影响藻细胞呼吸作用等进行抑藻。现有的研究报道中从有抑藻作用的植物中分离鉴定出的化感物质有没食子酸、豆蔻酸、壬酸、N-苯基-1-萘胺、N-苯基-2-萘胺和邻苯二酚等[13～17]。李霞发现大部分酚酸物质都具有化感作用[18]，而且其自氧化产物对铜绿微囊藻抑制作用显著，其中邻苯二酚和没食子酸是两种常见的酚酸类化感物质[19]。刘光涛等[20]发现常见的水生植物凤眼莲根系分泌物壬酸对铜绿微囊藻的抑制效果显著。除水生植物以外，从陆生植物提取出的化感物质也能破坏藻细胞的生长，倪利晓等[21]发现从黄花嵩茎叶中提取的青蒿素对铜绿微囊藻有良好的抑制效果，其作为抑藻剂的应用已经申请专利。

课题组前期研究发现青蒿素、壬酸、邻苯二酚单独作用于铜绿微囊藻时EC50为23.66mg/L、18.81mg/L、5.50mg/L。丁惠君等[19]研究发现没食子酸对铜绿微囊藻的EC50为1.73mg/L。本研究以铜绿微囊藻为实验藻种，在前期实验的基础上，进一步探讨了青蒿素、壬酸、没食子酸和邻苯二酚四种化学物质对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光的抑制效应的差异，以期为日后筛选和利用水生植物分泌的化感物质来控制水华做出有益的探究。

2 材料与方法

2.1 实验材料

青蒿素(artemisinin，分析纯)、壬酸(nonanoic acid，分析纯)、没食子酸(gallic acid，分析纯)和邻苯二酚(catechol，分析纯)均购置于上海阿拉丁试剂有限公司。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa，FACHB-937)购自于中国科学院水生生物研究所。

2.2 实验设计

2.2.1 铜绿微囊藻的培养

采用BG-11无菌培养基对实验所需铜绿微囊藻进行扩培，人工气候箱温度设置为(25±1)℃，光照强度设置为2 000 lx，光暗比 12 h∶12 h，每天摇动锥形瓶2～3次并适当调换位置。

2.2.2 实验设置

将铜绿微囊藻扩大培养到对数期，在含有250mL藻液的锥形瓶中加入相同质量浓度(12.4mg/L)的青蒿素、壬酸、没食子酸和邻苯二酚，并设置对照组，每组设置三个平行。测定第0d、1d、2d、3d、4d、7d的OD680值以及叶绿素荧光参数，并对结果进行处理和分析。

2.3 测定指标和方法

2.3.1 OD680和藻细胞计数

利用分光光度计测定铜绿微囊藻悬液在680nm处的OD值，根据提前绘制好的微囊藻生物量和吸光度之间的标准曲线(Y=8.796 3x+0.144 4, R2=0.998 5)计算细胞数[22]。

2.3.2 叶绿素荧光参数的测定

利用浮游植物荧光仪( PHYTO-PAM，Germany)测定铜绿微囊藻悬液中叶绿素a含量和叶绿素荧光参数。相关参数含义如下：

Fv/Fm指PSⅡ的最大光化学量子产量，是对光系统Ⅱ光化学反应可能达到的最大产量的评估，是研究外界环境胁迫等因素对光合作用影响的重要指标[23]；

Alpha，初始斜率，反映了样品对光能的利用效率[24]；

ETRmax，藻类最大光合速率，即最大相对电子传递速率[24]；

Ik，半饱和光照强度，反映了藻类对强光的耐受能力强弱[24]。

2.4 数据分析

利用WPS和origin9.0进行数据整理和作图，测得的数据取均值。采用SPSS20.0对处理组和对照组的结果进行单因素方差分析，设P<0.05两组之间存在显著性差异。

3 结果与分析

3.1 4种化感物质对铜绿微囊藻生长的影响

由图1可知，同一抑制浓度(12.4mg/L)下，邻苯二酚处理组对铜绿微囊藻的生长有显著影响(P<0.05)，实验第10d邻苯二酚的抑制率为83.49%；青蒿素和壬酸处理组随着实验时间的延长也表现出了对铜绿微囊藻的抑制作用，培养第10d青蒿素和壬酸的抑制率分别为24.50%和18.80%；没食子酸处理组实现初期表现出了对铜绿微囊藻的抑制作用，实验第2d、第3d和第4d的抑制率分别为28.61%、28.34%和26.89%，实验后期效果不明显。酚酸类物质容易氧化，自氧化产物对铜绿微囊藻抑制作用比较明显[25]；有研究表明，没食子酸在碱性、中性、强氧化条件下不稳定[26]，没食子酸后期表现不佳，没有达到同类物质邻苯二酚的抑藻效果，很有可能是本实验环境导致的；丁惠君等[19]则认为高浓度的没食子酸使得藻液呈弱酸性( pH为6～7) ，不易发生自氧化反应，这也可能导致没食子酸抑藻效果不如邻苯二酚；具体原因还有待进一步研究。

图1 4种化感物质对铜绿微囊藻生长影响Fig.1 Effects of four allelopathic substances on the growth of Microcystis aeruginosa

3.2 4种化感物质对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

铜绿微囊藻细胞内的叶绿素a主要位于光合系统Ⅱ的核心复合体上，能吸收能量传递到反应中心进行光化学反应[27]。当藻细胞受到环境胁迫时，其生理过程会受到影响，直接或间接地影响到叶绿素a含量，因此叶绿素 a 含量变化可以看成是藻类受到胁迫的生理反应指标[28]。由图2可知，邻苯二酚处理组对铜绿微囊藻的叶绿素a含量有显著影响(P<0.05)，实验第10d邻苯二酚处理组叶绿素a含量仅为对照组的10.30%，这一结果与图1所述的生长量抑制结果相符，铜绿微囊藻的生物量减少会直接造成叶绿素a含量下降；没食子酸处理组在实验初期叶绿素a含量显著低于对照组(P<0.05)，实验第1d、第2d和第3d的叶绿素a 含量分别占对照组的70.64%、68.91%和59.45%；青蒿素和壬酸处理组随着时间的推移对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响逐渐增大，实验第10d两组的叶绿素a含量分别占对照组的75.99%和84.31%。

3.3 4种化感物质对铜绿微囊藻Fv/Fm的影响

Fv/ Fm是光合系统Ⅱ在暗适应后的最大量子产量[29]，代表植物和藻类潜在光合能力，数值变化能够反映PSⅡ的受外界胁迫后的功能状态变化。

图2 4种化感物质对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响Fig.2 Effects of four allelopathic substances on chlorophyll a content in Microcystis aeruginosa

由图3可知，除邻苯二酚处理组外，其他4组包括对照组的Fv/Fm值维持在0.25～0.40之间；实验第一天时，除青蒿素处理组外，其他3个处理组较对照组而言，Fv/Fm值都下降了，其中壬酸组下降了12.18%，没食子酸组下降了17.00%，邻苯二酚处理组下降了95.18%，这说明壬酸、没食子酸、邻苯二酚抑制了铜绿微囊藻的光合活性，削弱了藻类的潜在光合能力；其中邻苯二酚处理组Fv/Fm值已经接近0，实验后期也维持了显著的抑制效果，这说明邻苯二酚从根本上破坏了铜绿微囊藻的光合系统Ⅱ的结构，因此胁迫效应显著；没食子酸处理组、青蒿素处理组和壬酸处理组后期数值高于对照组，则说明没食子酸、青蒿素和壬酸只是短期内抑制了铜绿微囊藻PSⅡ的光合活性，后期藻细胞光合功能得以恢复甚至增强。

图3 4种化感物质对铜绿微囊藻Fv/Fm的影响Fig.3 Effects of four allelopathic substances on Fv/Fm of Microcystis aeruginosa

3.4 4种化感物质对铜绿微囊藻α的影响

图4 4种化感物质对铜绿微囊藻α的影响Fig.4 Effects of four allelopathic compounds on α of Microcystella aeruginosa

由图4可知，除邻苯二酚处理组外，其他四组包括对照组的铜绿微囊藻α值维持在0.11～0.18之间；实验第一天时，除壬酸处理组外，其他3个处理组和对照组α值都下降了；随着时间的推移，壬酸处理组的α值在第三天开始下降；邻苯二酚处理组α值在实验第一天的时候已经接近0，实验后期也维持了显著的抑制效果，进一步说明邻苯二酚从根本上破坏了铜绿微囊藻的光合系统Ⅱ的结构；对照组的α值呈现下降趋势，很有可能是铜绿微囊藻大量生长，导致对光和其他营养物质的竞争加剧，因此削弱了藻细胞对光能的利用效率；而其他四个处理组，除了从根本上破坏了藻细胞PSⅡ的邻苯二酚处理组，实验第10d时，青蒿素组、壬酸组和没食子酸组的α值分别高于对照组24.07%、30.56%和71.29%。

3.5 4种化感物质对铜绿微囊藻ETRmax的影响

ETRmax反映了藻类的潜在最大光合速率，是光合活性的重要指标，可以指示藻类的“生长潜能”[30]。由图5可知，除没食子酸处理组外，其他四组的电子传递速率总体都呈现下降的趋势；邻苯二酚处理组ETRmax值在实验第一天的时候已经接近0，实验后期也维持了显著的抑制效果；青蒿素处理组的ETRmax值随着时间的推移越来越小，实验第10d时接近为0；这说明邻苯二酚和青蒿素对铜绿微囊藻的光合活性抑制作用是持续的，藻细胞的光合系统Ⅱ可能遭受到了不可恢复的破坏；壬酸处理组的ETRmax值与对照组的相近，实验第10d时略低于对照组；没食子酸处理组ETRmax值表现出了先增加后减小的趋势，但是始终高于其他三个处理组和对照组，实验第10d时显著高于对照组，Ihnken 等[31]发现藻细胞的非光化学猝灭( NPQ) 活性能影响光合作用电子传递速率，没食子酸处理组的铜绿微囊藻细胞ETRmax显著高于其他四组，这可能与藻细胞的NPQ有关。

图5 4种化感物质对铜绿微囊藻ETRmax的影响Fig.5 Effects of four allelopathic substances on ETRmax of Microcystis aeruginosa

3.6 4种化感物质对铜绿微囊藻Ik的影响

Ik值可以反映藻类对强光的耐受能力。由图6可知，邻苯二酚处理组Ik值在实验第一天的时候已经接近0，实验后期也维持了显著的抑制效果；青蒿素处理组的Ik值随着时间的推移越来越小，实验第10d时接近为0，与该处理组的ETRmax值变化规律相似，这进一步说明青蒿素对铜绿微囊藻的光合活性抑制作用是持续的；壬酸处理组的Ik值与对照组的相近，实验第10d时略低于对照组，这也和该处理组的ETRmax值变化规律相似，说明藻类潜在光合速率减小伴随而来的是对强光的耐受能力减弱；没食子酸处理组Ik值表现出了先增加后减小的趋势，但是始终高于其他3个处理组和对照组，实验第10d时高于对照组41.73%，这说明没食子酸增强了铜绿微囊藻对强光的耐受能力。