骨髓间充质干细胞移植治疗四氯化碳大鼠肝纤维化的实验研究

郑雪，李静，黄俊凯，丁新，陈卫刚

(石河子大学医学院第一附属医院消化内科，新疆 石河子 832000)

肝病是全球的高发疾病，根据《柳叶刀》发布的2017年GBD(The Global Burden of Diseases,Injuries,and Risk Factors Study 2017)，仅2017年全球由各种原因导致的慢性肝病、肝硬化及肝癌发病人数为6,108,000[1]。我国的肝病防治形势也不容乐观，2017年我国城镇居民肝疾病死亡率为5.85(1/10万)，其中肝硬化为5.08(1/10万)，而农村居民居民肝疾病死亡率为5.78(1/10万)，其中肝硬化4.92(1/10万)[2]。肝纤维化是多种慢性肝病向终末期肝病发展的中间环节，是各种致病因素导致的肝内纤维结缔组织异常增生，肝内细胞外基质病理性沉积的病理生理过程[3]。近年来研究发现，同种异体移植骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)能够有效改善肝纤维化大鼠的肝脏功能，降低肝纤维化程度[4-5]。BMSC是位于骨髓腔内的一种间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)，具有低免疫原性、免疫调节特性以及多向分化潜能，且来源丰富、易于体外培养、扩增，是治疗肝纤维化的新方法。

国内外大量研究证实MSC能够有效抑制肝纤维化程度，改善肝脏功能[6-7]。然而有一部分研究表明，BMSC移植后大鼠肝纤维化程度未缓解或缓解程度不显著。雷香丽等[8]发现移植BMSC后肝门静脉区和肝实质内仍有大量红染胶原纤维沉积形成假小叶，且BMSC组胶原面积大于阴性对照组。FORBES等[9]进一步研究发现肝硬化患者行骨髓移植后，有一部分BMSC没有分化为肝细胞而是转化为肌成纤维细胞。由于已有研究中对于BMSC疗效的争议，本实验拟用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)构建大鼠肝纤维化模型，同种异体移植BMSC后，探讨其对肝纤维化的治疗情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级SD雄性大鼠，体质量(180±20) g，购于新疆医科大学实验动物中心(实验动物生产许可证号：SCXK(新)2016-0003)，饲养于石河子大学医学院第一附属医院实验动物中心；L-DMEM(Gibco/美国)；胎牛血清(BI/以色列)；CD29-FITC、CD90-PE、CD45-FITC(eBioscience/美国)；四氯化碳(国药化学试剂公司/中国)；4%多聚甲醛(Abcam/英国)；RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司/中国)；SYBR© Select Master Mix(Applied Biosystems/美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSC的分离、培养及鉴定

取健康雄性SD大鼠，脱臼处死，于无菌条件下分离大鼠双侧股骨、胫骨，暴露骨髓腔，用完全培养基反复冲洗骨髓腔，缓慢吹打冲洗物。取200目细胞滤网，过滤冲洗物制成细胞悬液。将细胞悬液置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中静置培养。取第3代BMSC，流式细胞术测定CD29、CD90、CD45等细胞表面分子。

1.2.2 SD大鼠肝纤维化模型的建立

取健康雄性SD大鼠20只构建肝纤维化模型，另取6只正常大鼠作为空白对照组，每天12 h光照/黑暗交替，自由饮食。将肝纤维化模型大鼠随机分为BMCS组、PBS组，每组10只。采取CCl4法建模，建模周期为7周。分别给予 BMSC组、PBS组大鼠背部皮下注射50% CCl4-植物油溶液，剂量为3 mL/kg，每周2次。给予空白对照组大鼠背部皮下注射生理盐水，剂量为3 mL/kg，每周2次。

1.2.3 细胞移植

于造模后第8周，取细胞融合约80%～90%的第3代BMSC，用1×PBS溶液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液1 mL，经BMSC组大鼠尾静脉缓慢推注，PBS组经尾静脉推注等体积1×PBS溶液。移植BMSC后，继续按3 mL/kg，每周2次注射50%CCL4-植物油溶液维持肝纤维化。

1.2.4 肝脏功能检测及病理组织学检测

移植后第5周，采集大鼠血液及肝脏组织。全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(Albumin，Alb)；取大鼠肝脏左叶组织，约1 cm×1cm×0.5 cm，常规石蜡切片后行HE染色、Masson染色。取Masson染色切片，每个切片取3个不重复视野(×100)，以蓝色胶原沉积为阳性信号，用Image J图像分析软件测算CVF。另取部分肝组织(大小约为1 cm×1 cm×1 cm)，于-80 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.5 qRT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达

采用Trizol法提取大鼠肝脏总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板，利用SYBR© Select Master Mix试剂盒进行荧光定量检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 BMSC形态特征及鉴定

BMSC原代初接种时，细胞悬液中可见大量圆形、类圆形细胞，无明显特征。接种后48 h首次半量换液去除未贴壁细胞后，可见少量细胞贴壁，细胞呈圆形、不规则多边形及粗短梭形，细胞核大且核仁明显，细胞胞浆丰富，折光性好。原代培养第7天，见贴壁细胞数量有小幅增长，增殖速度较慢，贴壁细胞中不规则多边形、粗短梭形数量增多，细胞融合至90%以上时可见细胞呈旋涡状排列。BMSC传代后细胞增殖速度明显增快，细胞呈簇状分布，多为长梭形、不规则多边形，传代至第3代时，细胞形态趋于均一。流式分析结果显示，大鼠BMSC检测细胞表面分子CD29、CD90的阳性率分别为98.4%、99.6%，CD45的阳性率为：5.3%(图1)。

a—CD29-FITC：98.4%；b—CD90-PE：99.6%；c—CD45-FITC：5.3%图1 流式细胞检测BMSC表面标志物Fig.1 Flow cytometry to detect BMSC surface markers

2.2 BMSC对大鼠肝脏大体表现

空白对照组大鼠：色泽红润，表面光滑无结节，肝叶边缘锐利，质地柔软(图2a)。PBS组大鼠肝脏：较空白对照组大鼠肝脏缩小，颜色晦暗，呈棕褐色，表面弥漫大小不等结节，肝叶边缘变钝呈波浪形，肝脏质地变硬，门静脉明显增粗(图2b)。BMSC组肝脏：肝脏体积较空白对照组大鼠略大，肝叶边缘变钝，表面可见少量结节分布，质地微硬(图2c)。

a—空白对照组大鼠肝脏大体表现；b—PBS组大鼠肝脏大体表；c—BMSC组大鼠肝脏大体表现图2 大鼠肝脏大体表现Fig.2 Rat liver performance

2.3 BMSC对大鼠肝功的影响

移植后第5周，全自动生化仪检测大鼠ALT、AST、Alb。BMSC组大鼠的ALT、AST、Alb与空白对照组相比，差异无统计学意义；PBS组与空白对照组比较ALT、AST水平增高，Alb水平降低，且差异具有统计学意义；PBS组与BMSC组比较ALT、AST水平增高，Alb水平降低，差异具有统计学意义(表2、图3)。

表2 各实验组动物肝功指标及CVF值

Tab.2 Liver function indicators and CVF values of each experimental group

组别ALT(U/L)AST/(U/L)Alb/(g/L)CVF/%空白对照组40.40±14.0687.40±15.3735.84±3.950.20±0.09PBS组182.40±51.94ab253.20±40.70ab25.84±4.32 ab9.22±6.72 abBMSC组59.25±9.00102.10±11.7633.58±7.374.91±2.05 cF32.44454.4297.46412.666P0.0000.0000.0040.000

注：a与空白对照组比较，P<0.05；b与与BMSC组比较，P<0.05；c与空白对照组比较，P<0.05。

注：*P< 0.05;**P> 0.05。图3 各组实验动物肝功指标与CVF值的比较Fig.3 Comparison of liver function indicators and CVF value of experimental animals in each group

2.4 BMSC对大鼠肝脏病理组织学的影响

移植BMSC第5周时，取PBS组、BMSC组大鼠肝脏行HE、Masson染色。PBS组：桥接坏死范围广，累及多个小叶，小叶结构失常，出现门脉-中心静脉架桥样隔壁性纤维化；部分切片桥接坏死严重，可见假小叶形成，已达到弥漫性完全性肝硬化(图4a、c)。BMSC组肝脏切片可见：肝小叶网状支架结构存在，肝细胞多呈脂肪样或空泡样变性小叶周边炎症明显，部分肝小叶内可见嗜酸小体；汇管区炎症细胞浸润，部分汇管区出现碎屑样坏死；有胶原纤维存在，多在门脉区少量存在(图4b、d)。取PBS组、BMSC组Masson染色切片。利用Image J软件测算各组大鼠CVF值，与空白对照组相比，PBS组、BMSC组CVF均增高，差异具有统计学意义；与PBS组相比，BMSC组CVF降低，差异具有统计学意义(表2、图3)。

a—PBS组肝脏组织HE染色；b—BMSC组肝脏组织HE染色；c—PBS组肝脏Masson染色；d—BMSC组肝脏Masson染色(×100)图4 BMSC组、PBS组HE、Masson染色Fig.4 HE,Masson staining in BMSC group and PBS group

2.5 qRT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的结果

移植后第5周，分别取PSB组、BMSC组大鼠肝脏行qRT-PCR，检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白RNA表达。

与BMSC组相比，PBS组大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白RNA表达均增高，且差异具有统计学意义，结果见表3、图5。

表3 BMSC、PBS组大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原Tab.3 Type I and III collagen of rats in BMSC and PBS groups

注：*与BMSC组比较，P<0.05。

注：COL-1：Ⅰ型胶原；COL-3：Ⅲ型胶原。*P< 0.05。图5 PBS、BMSC组大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的qRT-PCR结果的比较Fig.5 the comparison of qRT-PCR results of type I and III collagen genes in PBS and BMSC groups

3 讨论与结论

肝纤维化是肝脏中纤维结缔组织异常增殖和积聚的一种病理状态，是机体对于各种急慢性肝损伤的修复反应。多种损伤因素通过不同途径导致肝实质细胞死亡[10]，肝内细胞外基质合成增多分解减少失衡，出现病理性沉积，最终导致肝硬化、肝性脑病、门静脉高压、肝功能衰竭甚至死亡[11]。因此治疗慢性肝病的关键是在祛除病因后，有效抑制肝纤维化进程。多项研究发现MSC具有减轻肝纤维化及改善肝脏功能的作用[4,5,12,13]。

MSC是中胚层来源的具有高度自我更新能力、多向分化潜能和低免疫原性的多能干细胞，而MSC在骨髓中含量较低，仅占骨髓中单核细胞0.002%～0.005%[14]。因此根据BMSC生物学特性，本研究采用全骨髓贴壁法分离扩增BMSC，通过流式细胞术检测BMSC表面标志物CD29、CD90阳性率均高于95%，而CD45的阳性率仅为1.3%，符合BMSC细胞表面分子特征。焦艳等[15]于肝纤维化造模第6周、第8周移植BMSC，证实于造模第6周时移植BMSC肝纤维化评分明显降低。而本研究分别于造模第5周、第6周、第7周后取大鼠肝脏行HE、Masson染色，发现造模第5周时门管区炎症细胞大量浸润，Masson染色可见汇管区血管周围有胶原纤维沉积，有或无短的纤维间隔向细胞内伸展，而第7周大鼠切片中可见汇管区血管周围有胶原纤维沉积，同时在肝索间可见长短不一的纤维间隔且无肝内假小叶形成，故本研究中选取造模后第8周移植BMSC。

在以往研究中发现，BMSC移植能够减轻早期肝纤维化的纤维化程度、改善肝脏功能[4,5,12,13]。本研究选择尾静脉作为移植途径，病理结果显示BMSC移植后紊乱的肝小叶结构有所恢复，纤维间隔变窄且数量减少，说明BMSC能够有效减少肝内胶原沉积，减轻纤维化程度。通过qRT-PCR 发现BMSC组大鼠肝脏内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达低于PBS组，证实了细胞外基质减少，纤维化形成得到有效控制。血清学指标显示BMSC组大鼠ALT、AST明显低于PBS组(P<0.05)，且Alb较之升高(P<0.05)，说明BMSC移植后不仅能够有效改善肝内纤维化情况，还可以促进肝细胞重生并且改善其功能。综上所述，本研究证实了同种异体移植BMSC可以有效减少肝脏胶原沉积，改善肝纤维化大鼠肝脏功能。然而由于造模时间较短，肝纤维化程度未达到肝硬化程度，本研究尚不能说明BMSC移植对于晚期肝纤维化是否具有同样疗效。此外，MSC治疗肝纤维化的机制尚不明确，目前认为主要与肝星状细胞活化、炎症反应及细胞外基质合成降解平衡有关[6,16-18]。因此，对于MSC治疗纤维化的机制需要进一步研究，为临床治疗提供相应动物实验证据。

近年来MSC已逐渐从动物实验走向临床，为临床肝纤维化提供了新的治疗策略。在自身免疫性疾病、脊髓损伤、糖尿病、神经退行性疾病等多种疾病治疗中，MSC也有良好的应用前景。然而，目前不论是动物实验还是临床试验对于MSC移植的安全性报道均较少，因此需要更多优质的临床试验数据，以确保干细胞治疗的安全性和有效性，维护患者利益。

同种异体移植骨髓间充质干细胞可以改善肝纤维化大鼠肝功能，减轻大鼠肝纤维化程度。