新疆寄生性杂草菟丝子主要种类鉴定

房小燕，姚兆群，陈美秀，曹小蕾，赵思峰

(新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

菟丝子是旋花科(Convolvulaceae)菟丝子属(Cuscuta)植物的总称，是一年生寄生缠绕草本植物，其无根、无叶或叶片退化为小的鳞片，没有叶绿素，通过吸器从寄主茎上吸收生长所需的水分和养分。除了在高纬度高海拔地区难以存活外，菟丝子在美洲、非洲、地中海地区、东南亚、太平洋诸岛等热带和亚热带地区广泛分布，菟丝子属有200多个种，其中Cuscutacampestris、Cuscutareflexa、Cuscutamonogyna等几个种给农作物、果树、花卉等造成的损失较为严重[1-2]。据《中国植物志》[3]报道，我国南北方均有菟丝子分布，在我国分布的有8种，另有3种仅有记载，没有标本。新疆是报道菟丝子种类最多的一个区域，已报道的种类达到8种以上[4-5]，这些报道的鉴定依据完全依赖于其缠绕的寄主和茎、花、硕果、种子等形态学特征，因寄主及生长环境的不同，菟丝子形态学特征变化较大，仅依靠形态学特征并不能得出准确的鉴定结果[6]。目前，菟丝子的鉴定方法有常规的形态学特征鉴定、化学分类标记法、色谱法、细胞学鉴定等[7]。随着分子生物学技术的快速发展，现代分子生物学手段应用于植物系统分类与品种鉴定的研究也越来越多，已有许多研究者[8-11]基于ITS、rps2、rbcL、trnL-F序列分析来鉴定区分菟丝子种类。菟丝子近几年在新疆的传播速度非常快，造成的危害也日益严重，给甜菜、制干辣椒、甜叶菊、绿化林木、花卉均已造成严重影响。因菟丝子属所有种类都是我国进境检疫对象[12]，新疆已报道的菟丝子种类在全国最多，对农产品调运带来较大麻烦，尽快明确新疆地区菟丝子的种类和分布有助于为检疫部门提供参考依据。本研究从南北疆的农田、绿化林带、荒漠等区域采集不同寄主上的菟丝子的茎、花和种子，对其采用形态特征及ITS、rbcL、trnL-F序列分析将其鉴定到种，明确新疆菟丝子的种类，从而为检疫部门确定检疫对象和科学防除方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从2017年7—10月份分别从巴音郭楞蒙古自治州、昌吉回族自治州、塔城地区、阿勒泰地区、石河子市周边农作物、田间杂草、绿化林木、果树、花卉等25种不同寄主上采集菟丝子的茎、花和种子，装入样品袋中带回实验室进行鉴定，样品具体信息见表2。

1.2 鉴定方法

1.2.1 形态学鉴定

将采集来60份菟丝子样品直接目测并置于体式显微镜下，观察茎的颜色和粗细，花的花序类型、花萼、花冠、雌蕊、雄蕊，种子的形状、种皮颜色、质感、种脐形状、晕轮形状等形态学特征进行鉴定[11,13-17]。

1.2.2 分子生物学鉴定

(1)菟丝子样品DNA的提取。从60份菟丝子种子样品中各取20粒，用75%乙醇处理30 s，10%次氯酸钠处理5 min，蒸馏水冲洗3次。采用改进的CTAB法提取样品植物的DNA[18]。

(2)ITS、rbcL、trnL-F序列的PCR扩增。PCR反应体系：2×PCR TaqMix (北京全式金生物)12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL(表1)、基因组DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至终体积为25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s (引物ITS5和ITS4；引物C和F)/55 ℃退火30 s (引物rbcL-f和rbcL-r)，72 ℃延伸40 s，30次循环；最后72 ℃延伸 10 min。反应完成后，在1.2%～1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。

表1 PCR引物详细信息Tab.1 PCR primer information

(3)ITS、rbcL、trnL-F序列分析及系统发育树构建。将不同引物的PCR反应产物委托北京六合华大基因公司进行测序。利用NCBI中BLAST和Clustal W软件进行同源性比较。选取不同地区不同寄主的菟丝子样品25份，将测定获得的ITS、rbcL、trnL-F序列在GenBank中用BLASTn程序分别下载同源序列。使用MEGA 6软件，对序列进行比对(alignment)，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，通过自举(bootstrap)对系统发育树进行检验，1000次重复。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

通过形态学初步观察，采集到的60份菟丝子样品依据茎的颜色、粗细，花的颜色和大小，以及种子的颜色和大小等各类特征，将其大致先分为2类：序号1—23的菟丝子样品的茎藤颜色大体为淡黄色至橘黄色，茎细丝状，直径为0.2～0.6 mm(图1 A)；序号24—60的菟丝子，茎藤颜色大体为微红色并有紫色瘤状突起，茎较粗，直径为1.2～2.8 mm(图1B)。

A—田野菟丝子；B—单柱菟丝子。图1 菟丝子茎形态特征Fig.1 stem morphologic characteristic of Cuscuta

序号1—23的菟丝子蒴果扁球形，不开裂。种子卵圆形，红褐色至黄褐色，较小，长1.1～1.9 mm，宽0.8～1.1 mm，背面圆拱(图2A)。种脐较短，椭圆形(图3A)；序号24—60的菟丝子蒴果卵圆形或球形，周裂。种子椭圆形，灰白色至棕褐色，较大，长2.6～3.4 mm，宽2.0～2.7 mm。背面平或微凹(图2B)。种脐较长，线形(图3B)。

序号1—23的菟丝子的花白色，花长2～4 mm，具腺体，有花梗，聚集成头状的团伞花序。花萼包藏花冠筒，花萼5片，裂片卵形或近圆形，或宽大于长。花冠裂片宽三角状，锐尖。雄蕊短于裂片，花药椭圆形，花丝比花药长或与之等长。鳞片卵形，边缘流苏状。子房球形。通常花柱2，纤细，约等长于子房，柱头头状(图4 A)；序号24—60的菟丝子的花玫红色或几白色，花长3～4.5 mm，花无梗或具短梗，花序松散穗状或穗状圆锥花序。花萼包藏花冠筒，花萼5片，裂片近半圆形，重迭，有紫色龙骨状突起。

A—田野菟丝子；B—单柱菟丝子。图2 菟丝子种子形态特征Fig.2 Seeds morphologic characteristic of Cuscuta

花冠裂片卵圆形，顶端钝，裂片裂至圆筒的一半。鳞片齿状，基部相连，并贴生在花冠上，顶端平截。花药无柄，着生在花冠的喉部。子房球形。花柱1，短，近与柱头直径等长，柱头头状，中央有浅裂缝(图4B)。

A—田野菟丝子；B—单柱菟丝子。图3 菟丝子种子种脐形态特征Fig.3 Umbilici morphologic characteristic of Cuscuta

根据以上几个形态特征将序号1—23菟丝子样品鉴定为田野菟丝子，序号24—60样品鉴定为单柱菟丝子。

2.2 分子鉴定结果

经ITS、rbcL、trnl-F 3个序列扩增后测序结果显示于下表2中，采集到的菟丝子样品序号1—23经过比对发现其ITS、rbcL、trnl-F序列均与GenBank数据库内已登录的田野菟丝子的相应序列同源性高达99%，序号24—60与经过比对发现其ITS、rbcL、trnl-F序列均与GenBank数据库内已登录的单柱菟丝子的相应序列同源性高达99%，测序后将测序结果提交到GenBank，获得ITS序列登录号为MH 392340—392399，trnL-F序列登录号为MH 392400—392459，rbcL序列已提交，还未获得登录号。

用MEGA 6软件对所选取的25个菟丝子样品的ITS，rbcL和trnL-F序列分别与从GenBank数据库中下载的同源序列进行比对并构建系统发育树(图5、图6、图7)。结果显示，ITS序列、rbcL序列、trnL-F序列测定产物2、4、5、6、8、9、10、13、15、16、17、18、19、21、23分别与已登录的相对应的序列C.campestris(KT 430863)、C.campestris(EU 330268)、C.campestris(KU 761502)序列相似率达99%；11、20、28、30、33、42、47、50、52、59与已登录的相对应的序列C.monogyna(AY 554405)、C.monogyna(KJ 436686)、C.monogyna(KX 168400)序列相似率达99%；ITS，rbcL和trnL-F序列分析结果表明，序号1—23为C.campestris，24—60为C.monogyna，所以本研究采集到的菟丝子样品经分子鉴定主要分为田野菟丝子和单柱菟丝子2种，与形态鉴定结果一致。

图5 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on alignment of ITS sequences data of Cuscuta samples

图6 基于rbcL序列构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on alignment of rbcL sequences data of Cuscuta samples

图7 基于trnL-F序列构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree based on alignment of trnL-F sequences data of Cuscuta samples

序号编号寄主采集地点采集日期分子鉴定ITSrbcLtrnL种名1K1铃铛刺库尔勒22团3连2017-8-14田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris2K2加工番茄库尔勒22团3连2017-8-14田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris3K3甜菜库尔勒22团15连2017-8-14田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris4K4辣椒库尔勒21团8连2017-8-15田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris5K5甜叶菊库尔勒21团良繁连2017-8-15田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris6K6甜菜库尔勒25团2连2017-8-16田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris7K7加工番茄库尔勒25团农技推广站2017-8-16田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris8K8拉拉藤库尔勒市市区2017-8-16田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris9K9矮牵牛喀纳斯景区2017-8-16田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris10H1粉苞苣哈密市伊吾县2017-8-17田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris11J1苦豆子第六师军户农场2017-8-17单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna12T1苍耳塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris13T2葱塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris

表2续

序号编号寄主采集地点采集日期分子鉴定ITSrbcLtrnL种名14T3甜菜塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris15T4田旋花塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris16T5荆芥塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris17T6小蓬草塔城163团4连2017-8-24田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris18T7苜蓿塔城168团4连2017-8-25田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris19T8苍耳塔城市阿西尔乡2017-8-25田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris20T9榆树塔城阿西尔乡2017-8-25单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna21A1小茴香阿勒泰188团9连2017-8-26田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris22E1榆树额敏县霍吉尔特乡2017-8-26单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna23E2苍耳额敏县霍吉尔特乡2017-8-26田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris24SHZ1苦豆子石河子市火车站2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna25SHZ2榆树石河子市火车站2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna26SHZ3白蒿石河子市火车站2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna27SHZ4芸香石河子市火车站2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna28SHZ5天仙子石河子市火车站2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna29SHZ6苦豆子石河子市农垦科学院内2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna30SHZ7铃铛刺石河子市农垦科学院内2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna31SHZ8榆树石河子市农垦科学院内2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna32SHZ9苍耳石河子市农垦科学院内2017-10-15田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.monogyna33SHZ10芦苇石河子农垦科学院内2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna34SHZ11榆树石河子市农垦科学院内2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna35SHZ12铃铛刺石河子市军垦第一连2017-10-15田野菟丝子田野菟丝子田野菟丝子C.campestris36SHZ13苹果树石河子市军垦第一连2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna37SHZ14苦豆子石河子市军垦第一连2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna38SHZ15小蓬草石河子市军垦第一连2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna39SHZ16榆树石河子市143团2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna40SW1榆树沙湾西树窝子村2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna41SW2苦豆子沙湾县西树窝子村2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna42SW3白蒿沙湾县西树窝子村2017-10-15单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna43H1榆树呼图壁县大丰镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna44H2苦豆子呼图壁县大丰镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna45H3榆树呼图壁县五工台镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna46H4苦豆子呼图壁县五工台镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna47H5小苹果树呼图壁县五工台镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna48H6榆树呼图壁县县城2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna49M1榆树玛纳斯县平原林场2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子(99%)单柱菟丝子C.monogyna50M2杨树玛纳斯县平原林场2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna51M3苦豆子玛纳斯县平原林场2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna52M4梧桐树玛纳斯县平原林场2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子(99%)单柱菟丝子C.monogyna53M5榆树玛纳斯县兰州湾乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna54M6苦豆子玛纳斯县兰州湾乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子(99%)单柱菟丝子C.monogyna55M7天仙子玛纳斯县兰州湾乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna56M8苦豆子玛纳斯广东地乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna57M9榆树玛纳斯县广东地乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna58M10白蒿玛纳斯县广东地乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna59M11枸杞玛纳斯县广东地乡2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna60M12榆树玛纳斯县包家店镇2017-11-7单柱菟丝子单柱菟丝子单柱菟丝子C.monogyna

3 讨论

菟丝子是世界性的杂草检疫对象，多数种类对其寄主都会造成一定程度的损害，近年来引起许多研究者的关注。据报道[1,3]，全世界分布的菟丝子属超过200种，我国大约有10种以上。目前报道记录的新疆地区菟丝子的种类是最多的，并且分布最广，危害最严重，其中阴知勤等[5]报道了新疆存在11种菟丝子，并描述了10种菟丝子的形态学特征、寄主及分布地区；马德英等[4,19]报道了新疆伊犁地区有4种菟丝子，并对新疆农田的8种菟丝子的种子外部形态特征和种胚形态进行了研究；严丽等[20]调查发现阿勒泰地区有3种菟丝子。以上文献报道调查的菟丝子种类都是基于菟丝子的茎、花和种子的形态特征进行区分，而研究发现同种菟丝子的茎的颜色、粗细，花的大小、颜色和种子形态特征确实存在明显差异[10]，并且对于新疆菟丝子种类调查不够全面、鉴定方法单一，存在极高的不准确率，所以菟丝子单一的形态学鉴定不能够完全准确的判定菟丝子的种类，需要加以分子辅助鉴定来进一步明确。艾尼古丽等[11]通过形态学特征和分子辅助鉴定相结合鉴定新疆石河子地区仅有田野菟丝子和单柱菟丝子2种。

本研究采集了来自新疆不同地区的25种寄主上的60份菟丝子样品，采用形态学特征和分子辅助鉴定相结合的方式，最终确定新疆地区的菟丝子主要是单柱菟丝子C.monogyna和田野菟丝子C.campestris2种，这与阴知勤等[5]报道的新疆存在11种菟丝子的结果有很大的差异，但本次研究所采集的菟丝子样品数量有限，要更加准确地确定新疆地区菟丝子种类还需要进一步扩大采样范围，增加采样数量。

4 结论

本研究在新疆南北疆各地菟丝子发生严重区域采集菟丝子样品60份，采用形态学鉴定和分子辅助鉴定相结合的方法，对60份菟丝子样品进行鉴定，明确新疆菟丝子主要是2种，即单柱菟丝子C.monogyna和田野菟丝子C.campestris。采集的60份菟丝子样品的寄主植物有25种，包括20种草本植物和5种木本植物。调查采样时发现单柱菟丝子多寄生木本植物，也可寄生草本植物；田野菟丝子仅发现在草本植物上有寄生。