小茴香中反式茴香脑的含量测定及其变化规律研究*

汪作元，李 敏，杨 静，柴 欣，王跃飞

（天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津 301617）

小茴香为伞形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill．）的干燥成熟果实，又名怀香、怀香子、茴香子，具有温肾暖肝、散寒止痛、理气和胃之功效[1]。小茴香常被用作调味品和香料，小茴香主要含有挥发油、脂肪油、甾醇、糖苷、氨基酸等多种成分[2]，挥发油是小茴香的主要药效成分[3]，现已从小茴香挥发油中分离出40种化合物，具有抗炎镇痛、抑菌、抗氧化等作用[4-5]。研究表明挥发油中主要成分为反式茴香脑，占挥发油含量的80%左右[6]，分布在叶、花、果实中，以果实中挥发油及反式茴香脑含量最高。反式茴香脑作为升白宁注射液的主要成分，对预防和治疗白细胞减少症具有良好的效果[7]。

小茴香中反式茴香脑易挥发，文献报道多采用GC[8-10]、GC-MS联用仪[11]等方法进行测定。反式茴香脑具有共轭结构，紫外吸收较好；液相色谱仪普及性高且操作便利性好。本研究建立了超高效液相色谱法（UPLC）测定小茴香中反式茴香脑含量的方法，并分析了小茴香及其盐制品中反式茴香脑的含量差异；研究了室温条件下小茴香药材（生品）及其粉末中反式茴香脑随放置不同时间的含量变化规律。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；DL-180E超声仪（50 kHz，180W）；XS205十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AL204型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 材料 小茴香药材（生品）（S1～S7），产地为内蒙古；其中药材S1～S4购自河北春开制药股份有限公司；药材S5～S7购自天津中药饮片有限公司。盐小茴香饮片（Y1～Y4）是作者参照盐制法炮制工艺炮制；盐小茴香饮片（Y5～Y7），产地为内蒙古，购自天津中药饮片有限公司；反式茴香脑（批号：18041304）购自成都普菲德生物技术有限公司；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸（色谱纯，阿拉丁）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 小茴香药材（生品）及粉末稳定性研究 取小茴香药材（生品）（S1）适量，等量分装于9个密封袋中，分别于 1、2、3、4、5、10、20、31、44 d 取样。

取小茴香药材（生品）（S1）适量，粉碎，粉末（过三号筛）等量分装于9个密封袋中，分别于1、2、3、4、5、10、20、31、44 d 取样。

取小茴香药材（生品）（S1）适量，粉碎，粉末（过三号筛）置于同一密封袋中，分别于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 取样。

2.2 盐小茴香饮片的炮制 小茴香药材（生品）200g，精密称定，置于炒药锅内，将小茴香翻炒均匀，炒至微显火色，喷淋25%盐水溶液（每100 kg小茴香用食盐2 kg），继续炒至微干，炒制15 min（功率1 300 W），取出，放凉。

2.3 对照品溶液的配制 取反式茴香脑对照品适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇配制成0．94mg/mL 的储备液，取适量储备液配制成 18．8μg/mL的对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取小茴香，粉碎，取粉末（过三号筛）0．5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入适量无水乙醇，密塞，室温下超声处理（功率144 W，频率40 kHz）10 min，放冷至室温，定容至刻度，摇匀，4℃下14 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，即得。

2.5 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC®BEH C18（2．1 mm×50 mm，1．7 μm）；流动相：甲醇-0．1%甲酸水（55：45），流速 0．3 mL/min；检测波长 254 nm；进样量2μL；柱温40℃；样品箱温度5℃。

2.6 方法学考察

现阶段，VR仍然处于发展初期，为使VR新闻的内容与形式发展转变，提高VR与新闻间的融合度，需要利用VR技术的沉浸式模式对VR新闻进行改造。在传递新闻内容上的感官体验时需要对新闻的生产方式进行更新，并从新闻的各环节着手，设立多样化的VR技术，让VR新闻快速发展。为使VR技术更好地运用于VR新闻中，提高VR新闻的价值，需要深入认识VR技术的功能，准确地实现信息间的转换。

2.6.1 线性关系考察 取适量反式茴香脑储备液配制成浓度为 2．35 ～ 150．40 μg/mL 的系列对照品溶液，按“2．5”项下色谱条件测定，平行进样 2 次，以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程，反式茴香脑线性回归方程为Yˆ=61 069X-12 840，相关系数r=0．999 9，表明反式茴香脑在 2．35 ～ 150．40 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.6.2 精密度实验 精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉），按“2．4”项下方法每天制备 1份小茴香供试品溶液，按“2．5”项下色谱条件重复进样6次，连续测定3 d，记录峰面积，计算其RSD值，日内精密度 RSD值为 0．40%，日间精密度 RSD值为1．11%，结果表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性实验 精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉）6份，按“2．4”项下方法制备小茴香供试品溶液6份，按“2．5”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算反式茴香脑平均含量为10．17 mg/g；RSD值为0．50%，表明该方法重现性良好。

2.6.4 稳定性实验 精密称取小茴香药材（生品）粉末（现粉），按“2．4”项下方法制备小茴香供试品溶液，按“2．5”项下色谱条件分别于 0．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5、4、4．5、5 h 进样测定，记录峰面积，计算反式茴香脑的稳定性RSD值为0．33%，表明供试品溶液室温放置5 h稳定性良好。

2.6.5 加样回收率实验 精密称取已知含量的小茴香药材（生品）粉末（现粉）0．25 g，准确加入与样品中反式茴香脑质量相当的对照品溶液，按“2．4”项下方法制备小茴香供试品溶液，平行6份，按“2．5”项下色谱条件进样测定2次，反式茴香脑的平均加样回收率为 102%，RSD=2．23%（n=6）。结果见表 1，表明反式茴香脑加样回收率良好，方法准确可行。

表1 小茴香药材（生品）中反式茴香脑的加样回收率实验结果（n=6）Tab.1 Test results of sam ple recovery rate of transanethole in raw Fructus Foeniculi（n=6）

2.7 小茴香药材（生品）、盐小茴香饮片中反式茴香脑的含量测定 采用已建立的UPLC分析方法测定不同批次小茴香药材（生品）、盐小茴香饮片。精密称取不同批次的小茴香粉末（现粉），按“2．4”项下方法制备小茴香供试品溶液2份，按“2．5”项下色谱条件每份供试品溶液进样测定2次，计算不同批次小茴香粉末中反式茴香脑的含量，小茴香中反式茴香脑UPLC色谱图见图1，结果见表2。7批小茴香药材（生品）中反式茴香脑的含量为 9．19～15．05 mg/g，2015年版《中华人民共和国药典》规定小茴香药材含反式茴香脑不得少于1．4%，小茴香药材（生品）（S1、S5～S7）不符合中国药典的规定，合格率低于50%；7批盐小茴香饮片中反式茴香脑的含量为9．09～16．02 mg/g，2015 年版《中华人民共和国药典》规定盐小茴香饮片含反式茴香脑不得少于1．3%，盐小茴香饮片（Y1、Y5～Y7）不符合中国药典的规定，合格率低于50%。通过分析4批样品炮制前后反式茴香脑的含量变化，盐制后小茴香中反式茴香脑略有变化。

图1 小茴香中反式茴香脑的UPLC色谱图（A、对照品溶液B、供试品溶液）Fig.1 UPLC chromatogram of trans-anethole in Fructus Foeniculi（A.standard solution B.samp le solution）

2.8 小茴香药材（生品）及其粉末放置不同时间对反式茴香脑含量的影响 反式茴香脑具有较强挥发性，其含量随小茴香放置时间延长不断下降[12-13]，本研究系统考察了小茴香药材（生品）及其粉末在室温下放置不同时间反式茴香脑的含量变化规律。

分别于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 取小茴香药材（生品）粉末适量，采用UPLC分别测定0 h样品中反式茴香脑含量 a0，n 小时（n=1、2、3、4、6、8、10、12）样品中反式茴香脑含量an。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）粉碎后12 h内反式茴香脑随放置时间延长含量不断下降，在12 h时，其含量下降了23．23%，实验结果见图2-A。分别于第1、2、3、4、5、10、20、31、44 天从不同密封袋取小茴香药材（生品）粉末适量，现取现测，采用UPLC分别测定了1 d 样品中反式茴香脑含量 A1，n 天（n=2、3、4、5、10、20、31、44）样品中反式茴香脑含量An。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）粉碎后在室温条件下放置44 d内反式茴香脑随放置时间延长含量不断下降，在44 d时，其含量下降了72．48%，实验结果见图2-B。

分别于第 1、2、3、4、5、10、20、31、44 天取小茴香药材（生品）适量，粉碎，现粉现用，采用UPLC分别测定1 d样品中反式茴香脑含量A1，n天（n=2、3、4、5、10、20、31、44） 样品中反式茴香脑含量 An。通过含量测定结果分析表明：小茴香药材（生品）在室温条件下放置44 d内反式茴香脑的含量基本稳定，其含量无明显变化，RSD值为2．90%，实验结果见图3。

图2 小茴香药材（生品）粉碎后在室温条件下放置12 h反式茴香脑的含量变化情况（A）、放置44 d反式茴香脑的含量变化情况（B）Fig.2 The variation of trans-anethole content in Fructus Foeniculi（raw）storaged at room tem perature for 12 h（A）and for 44 d（B）after pulverization

图3 小茴香药材（生品）室温下放置44 d现粉现测反式茴香脑的含量变化情况Fig.3 Thevariation of trans-anethole content in raw Fructus Foeniculistoraged at room temperature for 44 days（immediate detection after pulverization）

表2 不同批次小茴香药材（生品）、盐小茴香饮片中反式茴香脑的含量Tab.2 Contentsof trans-anethole in different batchesof Fructus Foeniculi（raw）and salt product pieces

通过系统研究小茴香药材（生品）及其粉末在室温下放置不同时间反式茴香脑的含量变化规律，揭示了小茴香药材（生品）粉末中反式茴香脑含量随放置时间延长不断下降，而小茴香药材（生品）中反式茴香脑含量基本稳定。因此，开展小茴香中反式茴香脑的含量测定时，小茴香必须现粉现测。

3 讨论

本实验利用UPLC建立了小茴香中反式茴香脑的含量测定方法，本方法样品前处理简便，分析速度快，紫外吸收好，无其他成分干扰。

本实验从提取溶剂（甲醇、乙醇）、溶剂比例（25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、无水乙醇）、提取温度[（0±5）、（20±5）、（40±5）、（60±5）℃]、提取时间（5、10、15、20 min）、料液比（1∶25、1∶50、1∶100）系统考察影响小茴香中反式茴香脑提取效率的因素，发现提取溶剂为无水乙醇、料液比为 1∶50、（20±5）℃超声10 min提取效率最高。

通过本实验研究，发现小茴香药材（生品）粉碎后反式茴香脑含量随放置时间延长不断下降，小茴香药材（生品）中反式茴香脑含量在规定放置时间内基本稳定。反式茴香脑为小茴香的指标成分，建议在进行小茴香中反式茴香脑含量测定时，小茴香必须现粉现测，即小茴香粉碎后，其粉末需在半小时内进行处理，保证测定结果的准确可靠。