穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的网络药理学作用机制

李 建，冷锦红

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

痛性糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的微血管并发症之一，主要累及感觉神经和运动神经，产生感觉及运动障碍。3%～25%的糖尿病患者会经历这种神经病理性疼痛，表现为肢体的疼痛、麻木，严重者会形成溃疡或坏疽，最终选择截肢，严重地影响了患者的生活质量［1］。由于其发病机制尚未阐明，现有的治疗只能缓解症状，而尚未有有效的治疗方法来逆转痛性糖尿病周围神经病变的进展。

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipppnicaMak.的干燥根，具有祛风除湿、舒筋活络、活血止痛等功效，在治疗腰腿疼痛、筋骨麻木、风寒湿痹、跌打损伤等疾病有明显疗效。现代药理研究表明，穿山龙有抗炎镇痛、调节免疫、抗肿瘤、降血脂、镇咳平喘等多种药理作用。有关穿山龙单品或提取物治疗痛性糖尿病周围神经病变的研究近年来多见报道［2-3］，但其药效物质基础和作用机制尚不明确。本研究从网络药理学［4］出发，从系统生物学和网络生物学的角度在分子网络调控的层面，通过对穿山龙药效成分进行计算机虚拟筛选，构建穿山龙活性成分-靶点-信号通路相互作用网络，认识中药穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变多成分、多靶点、多途径的整体作用机制。以期揭示穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的药效基础，为更好的开发治疗痛性糖尿病周围神经病变药物提供参考依据。

1 方法

1.1 分析平台 网络药理学实验研究的主要材料是分析软件和数据库，本研究中采用的数据库和分析软件主要有中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，Version：2.3）、TCM Database＠taiwan 数据库（http：//tcm.cmu.edu.tw／）、Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、Molinspiration 网站（http：//www.molinspiration.com／cgi-bin／properties）、PharmMapper 服务器（http：//59.78.98.102／pharmmapper／index.php）、UniProt 数据库（http：//www.uniprot.org／）、Genecards 数据库（http：//www.genecards.org／）、String 10.5 数据库（https：//string-db.org／cgi／input.pl）、DAVID 6.8 数据（https：//david.ncifcrf.gov／home.jsp）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路数据库（http：//www.genome.jp／kegg／）、CTD 数据库（http：//ctdbase.org／）、Cytoscape 3.5.1 软件。

1.2 化学成分的获得 以“穿山龙、穿龙薯蓣”为关键字，分别检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和台湾中医药资料（TCM Database＠taiwan），并参考国内外文献，对穿山龙的化学成分信息进行收集。将收集的化学成分逐一输入至Pubchem 数据库，下载这些成分的分子结构图，以∗.mol 的格式存储。

1.3 类药性分析 Lipinski 类药性五规则是药物分子设计和药物筛选的常用规则之一，可以比较准确地预测药物中化合物的吸收或渗透性能，使药物开发者能够尽早准确地筛选出有效药物成分，降低药物开发成本。将上述已获得的化合物在Molinspiration 网站中预测其吸收性质。之后依据LR［5］原则，对数据库分析出的穿山龙化学成分进行筛选：（1）相对分子量（MW）≤500；（2）氢键供体（与O 和N连接的氢原子数nOHNH）≤5；（3）氢键受体（O 和N 的数量，nON）≤10；（4）脂水分配系数（miLogP）≤4.15。满足上述至少2 种条件的化合物为口服活性药物。若数据库中化合物不符LR 原则但已有相关报道明确为穿山龙活性成分的化合物予以纳入。

1.4 靶点的预测与筛选 PharmMapper 数据库采用“反向药效团匹配方法”，以活性小分子为探针、搜寻潜在药物靶标、进而预测化合物生物活性［6］。因此，登陆Pharm-Mapper 数据库上传穿山龙活性成分的∗.mol 格式文件，将“Maximum Generated Conformations”值设为300，“Select Targets Set”设 为 Human Protein Targets Only（v2010，2241），“Number of Reserved Matched Targets（Max 1，000）”设为300，收集排名前100 的靶点。由于检索到的药物靶点存在命名不规范等问题，因此，本研究使用UniProt 数据库中UniProtKB 搜索功能，通过输入蛋白名称并限定物种为人，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称，经上述数据库检索和转化操作，获取与活性成分相关的蛋白信息，去除重复靶点后，同时获取这些靶点相应的基因名称。利用Genecards 数据库以“Painful diabetic peripheral neuropathy”为关键词，检索已报道的与痛性糖尿病周围神经病变相关的基因，与上述PharmMapper 数据库返回的靶点进行匹配，作为穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的潜在作用靶点。

1.5 靶点通路注释分析 通过DAVID 6.8 数据库对获得的靶点蛋白进行GO 富集分析和KEGG 通路注释分析，药物靶点富集的信号通路被认为是药物作用的重要通路。在CTD 数据库上以“Painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”为关键词检索痛性糖尿病周围神经病变相关信号通路，将得到的通路与上述通路进行匹配分析，作为穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的潜在通路。

1.6 蛋白相互作用网络构建与分析 为了阐明靶点蛋白在系统水平上的作用，本研究将穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的靶点蛋白导入String 10.5 数据库中，限定物种为人，通过参数设置将评分条件设定为＞0.90，以保证信息的高置信度，获取蛋白相互作用关系，结果保存成TSV格式，并将文件中的node1、node2 和combined score 信息导入到Cytoscape 软件绘制相互作用网路，将节点大小和颜色设置用于反映Degree 的大小，边的粗细设置用于反映Combine score 的大小，导出可视化图形进行研究分析。

1.7 构建“活性成分-靶标-通路”网络图 将27 个活性成分的预测靶点结果和通路分析，在Excel 表中分别构建“活性成分-靶点”“靶点-通路”之间的相互关系，然后将其导入到Cytoscape3.5.1 软件中建立“活性成分-靶点-通路”网络关系图。图中以活性成分、靶点蛋白和通路为3类节点（node），它们之间有相互关系的分别用边（edge）相连，节点的Degree 越大，则节点的大小越大，图中三角形节点代表活性成分，圆形节点代表靶点，菱形节点代表信号通路，经Cytoscape 3.5.1 软件处理，得到穿山龙相关靶点通路预测图。在此基础上，通过网络分析，探究其治疗痛性糖尿病周围神经病变的机制。

2 结果

2.1 穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的活性成分筛选 通过Database＠taiwan 数据库、TCMSP、Pubchem 和文献检索［7-8］的方式，收集到45 种化学成分，对其进行类药性分析，以进一步获得活性成分。此外，穿山龙中薯蓣皂苷、纤细皂苷虽不符合LR 原则，但已有研究［7］表明这两种化合物为穿山龙中含有量较高的活性成分，故均予纳入研究，因此共得到活性成分27 种。为方便后续研究，将它们分别编号为D1～D45，其中D1～D27 为穿山龙的潜在活性成分。详见表1。

2.2 穿山龙的主要活性成分靶点预测结果 通过Pharm-Mapper 服务器反向分子对接实验，预测出了27 种活性成分的作用靶点为316 个。通过与GeneCards 数据库搜索到的靶点进行匹配，筛选出穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变靶点129 个。其中，化合物diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）对应的潜在靶点最多，达到57个，提示了化合物D12、D23、D25 可能是穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的潜在有效成分。

2.3 GO 生物过程分析 通过对穿山龙活性成分作用靶点GO 富 集 分 析，结果 表 明，在 生 物 学 过 程（biological process）方面（图1），主要参与信号转导、蛋白水解、氧化还原、对缺氧的反应、蛋白质磷酸化、MAPK 级联等生物过程；在细胞组分（cellular component）方面（图2），主要存在于细胞质、核、质膜、线粒体等细胞组分当中；在分子功能（molecular function）方面（图3），主要参与蛋白质结合、锌离子结合、蛋白激酶活性、类固醇激素受体活性等分子功能。

2.4 KEGG 代谢通路分析 将穿山龙129 个治疗痛性糖尿病周围神经病变的靶点导入到DAVID 6.8 数据库中进行通路分析，取P＜0.05 的通路，通过KEGG、CTD 数据库及文献挖掘等方式，对计算出的通路进行综合分析。结果共富集到90 条信号通路，其中与痛性糖尿病周围神经病变密切相关的有33 条（表2），涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信号通路。富集结果表明，大多数基因显著富集到PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway 这3 条信号通路上，表明这些通路可能是穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的关键通路。

表1 45 个化合物信息

图1 穿山龙主要活性成分的生物过程（BP）富集分析

图2 穿山龙主要活性成分的细胞成分（CC）富集分析

图3 穿山龙主要活性成分的分子功能（MF）富集分析

2.5 PPI 网络的构建与分析 为了更好地理解穿山龙的作用机制，基于PPI 关系，利用String 10.5 数据库获取穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的靶点蛋白之间相互作用的关系，并导入到Cytoscape 3.5.1 软件中绘制相互作用网络，见图4。节点的大小和颜色表示Degree 值的大小，节点大小越大，颜色由橙色变蓝色对应的Degree 值越大；边的粗细表示Combine score，边越粗Combine score 值越大。PPI 网络包含129 个蛋白质节点，290 条相互作用关系（连线），平均Degree 为4.8，其中节点表示靶点蛋白，每条边表示靶点蛋白之间的作用关系。根据节点的Degree 绘制出Degree 排名前15 的Hub 蛋白质节点的条形图（图5）。包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基α（PIK3R1）、GTPase HRas（HRAS）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸蛋白激酶JAK2（JAK2）、胰岛素样生长因子I（IGF1）、白细胞介素-2（IL-2）等。穿山龙靶点蛋白PPI 网络图显示，这些靶点是网络的枢纽节点，是穿山龙抗痛性糖尿病周围神经病变的核心靶点。

表2 KEGG 代谢通路

图4 穿山龙靶蛋白PPI 网络

图5 各蛋白信息

2.6 穿山龙活性成分-靶点-通路网络构建 使用Cytoscape 3.5.1 软件构建穿山龙活性成分-靶点-信号通路网络图。直观地呈现了27 个活性成分、129 个靶蛋白、33 条作用通路和痛性糖尿病周围神经病变疾病间的关联（图6）。由此可见，穿山龙主要活性成分的作用靶点分布于不同的通路，相互协调、共同调节药物治疗痛性糖尿病周围神经病变的作用机制。从穿山龙活性成分-靶点-通路网络图中可知，穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的作用机制与代谢紊乱、血管损害、氧化应激的损伤、炎症反应、自身免疫的损伤等多种发病学说均有相关性，可从不同角度揭示穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的作用机制。

图6 化合物-靶点-信号通路网络图

3 讨论

目前，痛性糖尿病周围神经病变的发病机制尚未完全明确，研究认为痛性糖尿病周围神经病变的发病机制与代谢紊乱、血管损害、神经营养因子、氧化应激的损伤、炎症反应、自身免疫的损伤、遗传因素、神经元细胞膜离子通道功能障碍、蛋白激酶C（PKC）、致痛因子等因素相关。因此，痛性糖尿病周围神经病变的治疗主要通过控制血糖、营养神经、改善循环、改善代谢、抗氧化应激、抗炎镇痛等方式改善症状［9］。

穿山龙中的薯蓣皂苷元与薯蓣皂苷均为已报道的具有抗痛性糖尿病周围神经病变作用的活性成分。本实验前期研究已表明［3］，中药穿山龙提取物薯蓣皂苷（D2）可明显减少糖尿病大鼠血清致痛物质HA 和5-HT 的表达，疗效强于强的松。已有研究［2］表明，薯蓣皂苷元（D1）可改善STZ 诱导的糖尿病大鼠氧化应激和炎症水平以及抗氧化能力，增加机械痛阈和热痛阈值并降低疼痛。网络分析结果显示，化合物D1、D2 连接的靶点分子数目较多分别是54、44，因此，这两种活性成分是穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的关键成分。除此之外，未见其他化学成分有治疗痛性糖尿病周围神经病变的报道。本研究对获取的27 种具有相关生物活性的化学成分进行分析，发现diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）等对应的痛性糖尿病周围神经病变相关靶点个数最多，说明该成分可能是穿山龙发挥抗痛性糖尿病周围神经病变作用的重要成分，为进一步筛选其有效成分提供了理论依据。

蛋白质与蛋白质相互作用的网络显示，排名前15 的Hub 蛋白包括SRC、PIK3R1、STAT1、MAPK1、JAK2、IGF-1、IL-2 等。据报道，Src 激酶可通过调节TRPV1 通道，从而缓解STZ 诱导的糖尿病小鼠机械性异常性疼痛［10］。Mauvais-Jarvis［11］研究发现，PI3-激酶在胰岛素的代谢作用中起着核心作用，通过杂合破坏PIK3R1 基因可降低p85α，AS53 和p50α 的水平提高胰岛素敏感性，降低空腹和餐后血糖水平，并显著降低与遗传性胰岛素抵抗相关的糖尿病发病率；Chu 等［12］研究发现，系统性胰岛素样生长因子-1（IGF-1）治疗可逆转糖尿病周围神经病变小鼠的痛觉过敏现象并改善其活动能力，文献证明这些基因大都涉及炎症、氧化应激和胰岛素信号调节等环节，它们参与了痛性糖尿病周围神经病变基本病理生理过程。

穿山龙的靶点GO 富集分析结果表明穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变涉及信号转导、蛋白水解、氧化还原、对缺氧的反应、蛋白质磷酸化、MAPK 级联等生物过程，涉及细胞质、核、质膜、线粒体等细胞组分，涉及蛋白质结合、锌离子结合、蛋白激酶活性、类固醇激素受体活性等分子功能，是一个复杂的过程。KEGG 通路分析显示，穿山龙可能通过调节PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、VEGF 信号通路、PPAR 信号通路、TLRS 信号通路、JAK／STAT 信号通路等信号传导通路来调节血糖、抗氧化应激、抗炎镇痛从而发挥治疗痛性糖尿病周围神经病变的作用。

PI3K-Akt 信号通路存在机体内多种细胞中，对细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种生物过程起重要的调节作用。已有研究表明［13］，持续抑制PI3K／Akt 信号通路可缓解糖尿病神经病理痛的症状并改善其神经功能。此外，PI3K-Akt 信号传导通路的阻滞是外周组织胰岛素抵抗及2型糖尿病发生的最基本机制之一［14］。在KEGG 分析中，PI3K-Akt 信号通路是富集基因最多的信号通路，因此，推测穿山龙可通过抑制PI3K-Akt 信号通路，减轻疼痛症状的同时改善胰岛素抵抗，这为痛性糖尿病周围神经病变的治疗提供新方向，有望通过调控PI3K／Akt 信号通路来预防其发生。

MAPK 信号通路包括细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2），c-Jun 氨 基（N）-末 端 激 酶 1／2／3（JNK1／2／3），p38MAPK 和ERK5 四条途径［15］。MAPK 信号通路与肿瘤、炎症、氧化应激密切相关［16-17］。王超等［18］研究发现，通心络胶囊能够降低糖尿病周围神经病变小鼠氧化应激损失，改善坐骨神经中SOD、MDA、p-p38MAPK 的表达，同时能够提高痛阈值和神经传导速度；Sweitzer 等［19］研究发现，p38αMAPK 抑制剂SD-282 可改善STZ 诱导的糖尿病大鼠的机械性异常性疼痛、热痛觉过敏及福尔马林诱导的炎性疼痛，因此，通过干预MAPK 信号通路对糖尿病周围神经病变具有一定的保护作用。在KEGG 分析中，MAPK 信号通路是富集基因较多的信号通路，因此推测MAPK 通路可能是穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的关键通路。

血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的主要介质，VEGF 在糖尿病微血管并发症的发病机制中起重要作用。Di等［20］发现VEGF-B 可以减轻糖尿病小鼠感觉神经元中过量分泌的ROS，提示VEGF-B 的神经保护作用可能通过激活糖尿病感觉神经元的抗氧化防御实现；Li 等［21］研究发现，红花提取物和乙酰谷酰胺（SA）注射液能减轻糖尿病周围神经病变引起的神经损伤，其保护作用可能与促进VEGFB，NGF 和GDNF 的表达有关。VEGF-B 不仅可以保护中枢神经，还可以促进周围神经的损伤修复。在KEGG 分析中，VEGF 信号通路是富集基因较多，因此，调节VEGF 信号通路可能是穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的关键通路之一。

Toll 样受体（TLRs）是涉及先天免疫和病原体识别的天然免疫受体。TLR 通过募集衔接蛋白活化核因子-κB（NF-κB）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、干扰素（IFN）调节因子，来激动多个信号传导途经，以调节细胞因子，趋化因子和干扰素在炎症中的表达，在固有免疫系统中起着重要作用［22-23］。Yan 等［24］在链脲佐菌素诱导的痛觉过敏糖尿病大鼠中发现TLR4 mRNA 表达上调，此外，TLR4 表达与机械刺激的爪压撤回阈值和对热刺激的爪缩回潜伏期有关。TLR4 信号通路的两种下游促炎细胞因子TNF-α 和IL-1β 的蛋白水平也显著升高，并与糖尿病大鼠的机械／热超敏反应相关。最近有研究显示［25］，薯蓣皂苷可通过调节TLR4 ／MyD88 介导的氧化应激和炎症，对脂多糖诱导的急性肺损伤起保护作用。因此，笔者推测Toll 样受体信号通路可能是穿山龙发挥抗炎作用一条通路。

JAK-STAT 信号通路是近年发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫和炎症等许多重要的生物学过程［26］。最近有报道称，JAK／STAT 通路失调导致肥胖和糖尿病的发生［27］。Ma 等［28］发现抗氧化剂如白藜芦醇可通过抑制JAK／STAT 信号通路来抑制小鼠巨噬细胞中的炎症通路；Liu 等［29］在STZ 诱导的糖尿病心肌纤维化大鼠中发现硫化氢（H2S）可改善糖尿病大鼠心肌纤维化，其机制可能与下调JAK ／STAT 信号通路有关，从而抑制氧化应激和ER 应激，炎症反应和细胞凋亡。因此，JAK ／STAT 信号通路可能是穿山龙发挥抗炎、抗氧化应激的一条潜在通路。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是参与多种生理过程的配体激活转录因子，在诸如葡萄糖和脂质代谢，能量平衡，细胞增殖，炎症，免疫和肿瘤等方面均有着举足轻重的作用。PPARs 由PPARα、PPARβ 和PPARγ 3 种亚型组成［30］，其中PPARγ 是PPAR 通路最为重要的靶点，PPARγ 具有抗炎和抗氧化应激的作用［31］。目前，PPARs 激动剂已经广泛应用于糖尿病、脂质紊乱、代谢综合征等疾病的临床治疗。说明了穿山龙可能通过作用于PPARγ 蛋白调控PPAR 通路来调节血糖、改善炎症和氧化应激。此外，KEGG 分析显示穿山龙还可通过INSR、MAPK1 等靶点与胰岛素信号通路、AMPK 信号通路来控制糖脂代谢的正常运行。

痛性糖尿病周围神经病变在中医学中属于“消渴痹症”范畴，消渴日久，损伤气阴，气血运行不畅致瘀血阻滞络脉，络脉淤闭，不通则痛，因此，“血瘀”和“络损”是消渴痹症的基本病机之一。中药穿山龙具有活血通络止痛之功效，对于“络脉瘀阻”所致的该疾病具有良好疗效。张兰教授［32］认为除微血管和微循环之外，神经组织在形态和功能上与中医的“络脉”也很类似，并将其归属“络脉”范畴；现代医学认为，痛性糖尿病周围神经病变的发病主要受两方面因素影响，即血液供应受损的血管因素和神经元或神经纤维内部因高血糖导致病理生理改变的代谢因素［33］，这与中医“血瘀络损”的病机观有一定相似性。本研究根据网络药理学方法，预测了穿山龙活血通络止痛的治疗机制可能通过调节血糖，改善氧化应激水平，减轻神经血管损伤，抑制炎症反应，从而缓解糖尿病神经病理性疼痛。

综上所说，本研究基于网络药理学研究方法，通过靶点预测、类药性分析、GO 基因富集分析和KEGG 通路注释分析技术构建了穿山龙靶点蛋白相互作用网络和活性成分-靶点-信号通路网络，从系统层面研究了穿山龙活性成分治疗痛性糖尿病周围神经病变多成分-多靶点-多信号通路的作用机制。从理论预测、整体分析角度，阐明了穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的潜在作用机制，为未来验证穿山龙治疗痛性糖尿病周围神经病变的作用机制提供了思路与线索。