丁香酚对异齿裂腹鱼的麻醉效果

王万良，王金林，曾本和，古桑德吉

（1.西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，西藏 拉萨 850000；2.西藏自治区农牧科学院，西藏 拉萨 850000）

丁香酚（Eugenol）是一种植物香料，广泛存在于丁香油、樟脑油和肉桂叶油等芳香油中[1]，能抑制鱼类的脑皮质而丧失触觉，然后作用于基底神经节和小脑，使鱼类处于极度兴奋状态，之后作用于脊髓达到麻醉鱼类的作用[2]。丁香酚及其代谢物能很快从血液和组织中排出，不会诱发机体产生突变物质，广泛添加在食品中[3]。根据联合国粮农组织及世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会报告，每天摄入150mg 丁香酚不会危害人类健康[4]。与美国国家食品及药物管理局（FDA）推荐的渔用麻醉剂MS-222 相比，丁香酚的毒性更小，很多国家如澳大利亚、智利、芬兰、新西兰等认为丁香酚无残留期，是合法的水产麻醉剂[5]。Kildea 等[6]研究了丁香酚在银鲈Bidyowas bidyous 体内积累与清除时发现，48h后未在鱼体中未检出丁香酚。我国尚未明确规定水产用何种麻醉剂，但丁香酚成本较低、效果好、安全性高等，被广泛用于亲鱼的采卵、活鱼运输等生产活动和解剖科学试验中[7]，我国已对中华鲟Acipenser sinensis、倒刺鲃Spinibarbus denticulatus、大黄鱼Larimichthys crocea、虹鳟Oncorhynchus mykiss、大西洋鲑Salmo salar 等鱼类进行了麻醉试验，并获得了较好的效果[8-12]。

异齿裂腹鱼Schizothorax oconori 俗称棒棒鱼，属鲤形目Cypriniformes、鲤科Cyprinidae、裂腹鱼亚科Schizothoracinae、裂腹鱼属Schizothorax，主要分布于雅鲁藏布江上、中游的干支流及附属水体，是西藏主要的土著经济鱼类之一[13]。近年来，由于人为干预频繁，该鱼部分江段数量锐减，严重破坏了雅鲁藏布江渔业资源[14]。早期研究了异齿裂腹鱼的分类学、起源、演化和分子系统发育[15,16]；随之分析了该鱼的染色体组型和间冰期生境的改变对其时空分布的遗传结构产生的变化[17-19]；还进行了异齿裂腹鱼繁殖、发育、养殖和行为生物学等研究[20-22]。本试验研究丁香酚对野生异齿裂腹鱼的麻醉效果，可为异齿裂腹鱼资源调查、人工繁育操作及运输提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

丁香酚（C10H12O2）（2-甲氧-4-丙烯基酚）相对分子量为164.2，纯度≥99%，淡黄色液体，难溶于水，易溶于醇类、醚或冰醋酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产。

异齿裂腹鱼购自拉萨药王山水产品批发市场，在拉萨国家级现代农业科技园区水产养殖基地平列槽中暂养，水源为曝气地下水，水温保持在12～13℃，溶氧≥7mg/L，pH=7.8。试验选择体色正常、体表完整、体格健壮、活力强的鱼进行试验。

试验容器1.2 m×1.0 m×1.0 m，连续曝气供氧，保持溶氧≥7mg/L，水温12.5℃。丁香酚与无水乙醇按体积1∶9 的比例配置成母液备用，试验时现配现用，配置药液充分搅拌，均匀后静置15 min。

1.2 方法

采用静水方法，使用较大质量浓度范围的丁香酚对体质量相近的异齿裂腹鱼进行麻醉预试验。麻醉阶段分为A0～A45 个阶段，复苏阶段划分为R1～R44 个阶段，具体划分标准见表1[23]。当鱼停止游动，完全失去反应能力，仅鳃盖正常张合时，即判断为麻醉期（A4）；当身体平衡、反应灵敏，鳃盖张合正常，即判断为鱼已复苏（R3）。通常将3min 内完全麻醉，5min 内恢复自然状态的丁香酚浓度作为理想麻醉质量浓度。

表1 异齿裂腹鱼麻醉与复苏阶段划分Tab.1 Classification of anaesthesia and recovery stages of Schizothorax oconori

1.2.1 不同质量浓度丁香酚对异齿裂腹鱼麻醉的影响试验

试验设9个质量浓度：10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 和60 mg/L，试验鱼平均体质量为（1 072±101）g，每个处理3 个平行组，每个平行组10 尾。记录麻醉时间、复苏时间，复苏尾数与麻醉尾数比值为复苏率。试验结束后在平列槽暂养3d，观察成活率。

1.2.2 不同质量浓度丁香酚对异齿裂腹鱼呼吸频率的影响试验

试验选择平均体质量为（980±86）g 的异齿裂腹鱼45 尾，随机分9 组，每组5 尾，分别放入质量浓度为0 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L 和50 mg/L 水体中，测定其1～7 min 内鳃动次数。进入深度麻醉后迅速捞出放入清水复苏，记录复苏尾数和3 d 后死亡尾数。

1.2.3 相同质量浓度丁香酚对不同规格异齿裂腹鱼麻醉影响试验

选择平均体质量为（480±72）g、（1 036±84）g和（1 526±123）g 的异齿裂腹鱼，在质量浓度30mg/L条件下进行试验，每组10 尾，3 个平行，记录麻醉时间、复苏时间、复苏率和死亡率。

1.2.4 空气暴露时间对深度麻醉鱼体复苏的影响试验

选择平均体质量（1 132±116）g 异齿裂腹鱼在质量浓度30mg/L 深度麻醉，在空气中暴露0s、300s、600s、900s、1200s、1500s、1800s、2100s 和2400s，随后迅速放回清水中进行复苏，记录复苏时间、复苏尾数和死亡尾数。1.2.5 数据处理

数据通过Excel2007 软件进行处理，用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，用Duncan's 法进行多重比较，以P＜0.05 为各组之间差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度丁香酚对鱼的麻醉效果

由图1 和表2 可知，当丁香酚浓度在10～60mg/L 范围内，随着丁香酚质量浓度增加，麻醉时间依次递减，在质量浓度35mg/L、40mg/L 和50mg/L 时，麻醉时间差异不显著（P＞0.05），质量浓度与麻醉时间的相关式为：Y=1516.8e-0.059X，R2=0.9771；而复苏时间则随着丁香酚的质量浓度的递增依次延长，在15mg/L、20mg/L 和25mg/L 质量浓度时，复苏时间差异不显著（P＞0.05），质量浓度与复苏时间的相关式为：Y=0.1344X2+2.964X+357.12，R2=0.9111，复苏率均为100%，3d 后死亡率为0。

图1 不同质量浓度丁香酚对异齿裂腹鱼的麻醉效果Fig.1 Anesthetic effect of Schizothorax oconori exposed to different concentrations of eugenol

表2 不同质量浓度丁香酚对异齿裂腹鱼体的麻醉效果Tab.2 Anesthetic effect of Schizothorax oconori exposed to different concentrations of eugenol

2.2 不同质量浓度的丁香酚下异齿裂腹鱼的呼吸频率

如图2 所示，平均体质量（980±86）g 的异齿裂腹鱼在麻醉的初始阶段，呼吸频率轻微升高。在7 min 之内，10mg/L、15mg/L、20mg/L 和25mg/L 麻醉组与对照组（0mg/L）趋势的相似。观察发现，试验鱼未进入麻醉期（A3）之前，呼吸频率变化不明显，基本维持在90 次/min 左右。当丁香酚质量浓度为30～50 mg/L 时，呼吸频率随时间的推移而明显变化，质量浓度越高，呼吸频率降低越快；质量浓度为35 mg/L 时，3 min 后进入深度麻醉期（A4），而质量浓度为40mg/L 和50mg/L 时，2min 即可进入深度麻醉期（A4），随后呼吸频率降低为0。

图2 不同质量浓度丁香酚对异齿裂腹鱼呼吸频率影响Fig.2 Effects of eugenol at different concentrations on respiratory frequency of Schizothorax oconori

2.3 丁香酚对不同规格异齿裂腹鱼的麻醉效果

如图3 所示，在丁香酚质量浓度为30 mg/L 时，随着鱼体质量增加，麻醉时间依次减少，平均体质量（1 000±56）g 与（1 500±56）g 异齿裂腹鱼麻醉时间差异不显著（P＞0.05），二者与平均体质量（500±56）g 麻醉时间差异显著（P＜0.05）；复苏时间随着体质量增加依次递增，平均体质量（500±56）g与（1 000±56）g 异齿裂腹鱼麻醉时间差异不显著（P＞0.05），二者与平均体质量（1 500±56）g 麻醉时间差异显著（P＜0.05），复苏率均为100%，3d 后死亡率为0。

2.4 空气暴露时间对深度麻醉鱼体复苏的影响

由表3 和图4 可知，在0～1 600 s 范围内，随着空气暴露时间增加，平均体质量（1 132±116）g 异齿裂腹鱼复苏时间依次递增，空气暴露600s，与300s 和900 s 时复苏时间差异不显著（P ＞0.05），与其他时间差异均显著（P＜0.05）；空气暴露1 800 s，与1 500s、2 100s 和2 400 s 差异不显著（P＞0.05），与其他差异均显著（P＜0.05）；空气暴露1 800s、2 100s和2 400 s 之间差异不显著（P＞0.05）；空气暴露2 400 s时，复苏率为80%，3 d 后死亡率为20%；其余各组复苏率均为100%，3d 后死亡率为0；空气暴露时间与复苏时间的相关式为：Y=0.4009X+527.76，R2=0.9537。

图3 丁香酚对不同体质量异齿裂腹鱼麻醉效果的影响Fig.3 The anesthesia effect of eugenol on Schizothorax oconori with various body weights

3 讨论

我国是水产养殖业大国，水产养殖生产和科研活动中广泛应用麻醉剂，目前使用较多的鱼类麻醉剂有30 多种，包括MS-222、2-苯氧乙醇和硫酸喹哪啶等[23]。科学合理使用麻醉剂能够使鱼体保持相对安静，降低采卵、采精和采血等操作时的应激反应，能高效、顺利完成测量和采样工作；在长途运输中，麻醉剂可以降低鱼体新陈代谢，减少伤害，提高运输成活率。近些年，丁香酚价格低、对人体和鱼体较安全，麻醉效果高，已广泛应用于水产业。

表3 空气暴露时间对麻醉的异齿裂腹鱼复苏的影响Tab.3 Effects of air exposure time on recovery of anesthetized Schizothorax oconori

据Marking 和Meyer[24]、Meyer 等[25]研究，通常将180s 内完全麻醉，300s 内恢复自然状态的麻醉剂剂量定为最适麻醉质量浓度。刘艳超等[25]研究了MS-222 对两种规格的异齿裂腹鱼麻醉效果研究，大规格[体长为（25.0±1.5）cm]和小规格[体长为（14.8±2.3）cm]在有效浓度150mg/L 条件下，均在250s 内完全麻醉，恢复时间分别为250s 和420s。周裕华等[26]研究了丁香酚对鲻Mugil cephalus 的麻醉效果，在麻醉时间小于180s，复苏时间小于300s时，丁香酚的理想麻醉质量浓度为30mg/L。本试验结果表明，随着丁香酚质量浓度的增加，麻醉时间缩短，复苏时间延长，这与大多数学者研究结果一致[27-29]；丁香酚浓度在35～60 mg/L 范围内，均可以使异齿裂腹鱼在180 s 内完全麻醉；其中在质量浓度为60 mg/L 时，麻醉时间最短，显著低于其他各实验组，但复苏时间很长，需要1 001s，与刘艳超使用MS-222 对大规格异齿裂腹鱼麻醉效果类似，大于理想复苏时间300 s，原因可能是丁香酚对异齿裂腹鱼极为敏感有关；平均体质量为1 072g 异齿裂腹鱼至少在20 龄以上，可能造成其复苏时间延长。

低浓度丁香酚抑制了异齿裂腹鱼的运动和感觉，但呼吸频率并没有发生较大变化；相反，高浓度丁香酚明显影响了呼吸频率，可能原因是鱼呼吸中枢的麻醉需要更高浓度的阈值；观察发现，呼吸频率的降低基本处于深度麻醉的过程（A3～A4），说明这一阶段鱼体的呼吸中枢受到了抑制，这与贾超峰等用丁香酚麻醉真鲷Pagrosomus major×黑鲷Acanthopagrus schlegelii 杂交子一代的效果一致[30]。

一般情况下，丁香酚的麻醉效果与鱼体的种类、规格和年龄等因素有关，但也有报道不同规格罗非鱼Oreochromis mossambicus 与麻醉效果没有明显的相关性[31]。本试验在30 mg/L 质量浓度条件下，小规格异齿裂腹鱼麻醉时间较长，而复苏时间较短，说明小规格异齿裂腹鱼对丁香酚的耐受性更强，这与李靖等对大西洋鲑的研究结果一致[32]。可能原因是小规格鱼体鳃部面积较窄，单位时间水交换较少，脑体指数较大所致[33]。鱼体在空气中暴露主要用于一系列样品采集、生物学数据收集及人工繁殖操作。本试验可知，异齿裂腹鱼深度麻醉后，随着空气中暴露时间越长，复苏时间呈现一个递增的变化趋势，这与严银龙等对刀鲚Coilia nasus 的研究结果一致[34]，而与张志山等对翘嘴鲌Culter alburnus 的研究结果相反[35]，可能原因是种类不同所致，具体因素还待进一步研究。小结

麻醉剂通过抑制其中枢和周围神经系统，使鱼体保持安静，减少应激损伤，在渔业生产中被广泛应用。丁香酚对异齿裂腹鱼麻醉有效质量浓度30～35mg/L，在开展科学试验及研究中MS-222 为首选麻醉剂，但考虑商品鱼药残，丁香酚优于MS-222。