云南与新疆产分心木水提物急性毒性研究
2019-10-23张盼盼沈磊杨涵李鹏董相林逢春姜北
张盼盼 沈磊 杨涵 李鹏 董相 林逢春 姜北
【摘 要】 目的:考察云南与新疆两种分心木提取物的急性毒性,为更好地认识分心木药用安全性提供实验依据。方法:昆明种小鼠灌胃两种分心木提取物,1次/d,连续14d,期间给小鼠称体质量并观察其行为学,Bliss法计算半数致死量(LD50),分离小鼠不同组织以HE染色法进行染色,观察其病理学变化。结果:云南和新疆分心木水提物的LD50分别为21.5 g/kg和12.4g/kg;所有剂量分心木对小鼠体质量无影响;部分剂量分心木使小鼠活动减弱且会引起心脏和肝脏组织坏死。结论:云南和新疆分心木水提物均存在着一定的急性毒性作用。
【关键词】 分心木;水提物;急性毒性;LD50;组织病理学
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2019)14-0022-04
分心木(Diaphragma Juglandis Fructus)为核桃(Juglans regia L.)果实子房室的木质中隔,也称作胡桃衣、胡桃隔和核桃栅等[1-2]。临床上主要用于治疗遗精滑泻、尿频遗尿、崩漏、带下、泄泻和痢疾等病症[3-4]。分心木化学成分研究发现,其主要含有黄酮及其苷类成分、酚性化合物、有机酸、甾体、皂苷等[5-7]。值得注意的是,新疆分心木中含有大量木脂素类成分[8],此类成分在其他产地的分心木中尚未见有研究报道。近年来民间常将分心木用作保健品,用于对高血糖、高血脂等病症的辅助治疗与日常保健,但确切疗效不是十分清楚。至于分心木使用的安全性,虽然《本草再新》等传统中医药典籍中记载分心木“味苦涩,性平,无毒”,但尚未见有确切的分心木急性、慢性毒性方面的现代研究报道。为保证分心木使用安全,根据我国核桃分心木主要产地分布情况[9],笔者选取了云南大理和新疆喀什两大核桃主产区的分心木水提物进行急性毒性研究。
1 材料与方法
1.1 供试品 云南分心木2017年5月采自云南省大理州漾濞县;新疆分心木2017年5月采自新疆喀什地区。分别称取干燥云南分心木和新疆分心木,粉碎,过120目筛,加入蒸馏水于90(C回流,共提取三次,合并提取液,浓缩、冻干,分别得到云南分心木水提物和新疆分心木水提物冻干粉。
1.2 实验动物 SPF级昆明种小鼠,雌雄各半,体质量18 ~ 22 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(湘)2016-0002。小鼠分笼饲养于独立通气笼中,室温(21±2)℃。
1.3 试剂 HE染液、乙腈和甲醇(色谱纯),美国 Sigma公司;HP-20大孔树脂,日本三菱公司;其余试剂均为分析纯。
1.4 仪器 小鼠独立通气笼(苏州市苏杭科技器材有限公司);ASP300S脱水机/RM2245切片机(德国莱卡公司);BMJ-C包埋机/PHY-III病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司);AP280-1冷冻台(英国MICROM有限公司);CX41RF显微镜(日本奥林巴斯有限公司);Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。
1.5 方法
1.5.1 分心木水提物的LD50测定[10-11] 经过预实验确定云南分心木引起小鼠全死的剂量LD100为28.4 g生药/kg,全活的剂量LD0为9.28 g生药/kg;新疆分心木引起小鼠全死的剂量LD100为17.04 g生药/kg,全活的剂量LD0为6.43 g生药/kg。为精确计算LD50,设置正式实验分7个剂量组,计算得云南分心木相邻两组间的剂间比r=1.205,新疆分心木相邻两组间的剂间比r=1.177。根据预实验结果,取昆明种小鼠150只,雌雄各半,按体质量随机分为15组,每组10只,分别为正常对照组(不参与计算LD50,用于其他毒性指标的比较)、云南分心木7个等比剂量组、新疆分心木7个等比剂量组。小鼠禁食不禁水16 h后灌胃不同剂量的两种分心木,正常对照组灌胃蒸馏水,给药体积为20 mL/kg,给药后第1、4、10小时分别观察1次,之后每天观察1次,连续14 d。观察期结束后,根据各组小鼠死亡数,计算云南分心木和新疆分心木的LD50和95%置信區间。
1.5.2 对小鼠体质量和行为学的影响 在观察期内,每天给小鼠定量喂食(3 g/只/d),每2天称体质量;每天观察小鼠的运动功能,有无惊厥等异常行为表现。
1.5.3 对小鼠脏器指数和组织病理学的影响 将观察期内死亡小鼠和14 d后存活小鼠脱臼处死后的新鲜组织(心、肝、脾、肺、肾)分离,生理盐水清洗后滤纸吸干,精确称量各脏器质量,根据体质量计算脏器指数 = 脏器质量/体质量 × 100%。然后将一部分脏器组织置于10%中性甲醛固定,常规脱水,包埋,切片后进行HE染色,于光学显微镜下观察各脏器组织病理学变化。
1.6 数据处理 使用BL-420F软件(成都泰盟软件有限公司)对各组小鼠死亡率进行分析,Bliss法计算LD50和95%置信区间;体质量和脏器指数用(x±s)表示,使用SPSS19.0软件对数据进行分析,单因素方差分析总体差异,LSD法比较组间差异,P<0.05表示有统计学差异。
2 结果
2.1 分心木水提物对小鼠体质量的影响 与正常对照组相比,观察期内,云南和新疆分心木水提物不同剂量组小鼠的体重变化均无显著性差异。
2.2 分心木水提物对小鼠行为学的影响 与正常对照组比较,给药10 h内,除9.28 g生药/kg的云南分心木和6.43 g生药/kg的新疆分心木水提物组小鼠外,其他剂量组小鼠均出现活动减弱的行为;给药48 h后,28.40 g生药/kg的云南分心木和17.04 g生药/kg的新疆分心木水提物组的小鼠活动依旧较少,其余各组小鼠行为学均无异常。
2.3 分心木水提物的LD50测定 使用Bliss法计算,结果为云南分心木水提物的LD50为21.50 g生药/kg,95%置信区间为17.56~32.84 g生药/kg;新疆分心木水提物的LD50为12.40 g生药/kg,95%置信区间为10.71~15.39 g生药/kg。结果表明新疆分心木水提物对小鼠的致死毒性强于云南分心木。见表1。
2.4 分心木水提物对小鼠脏器指数的影响 由表2可知,与正常对照组对比,除13.47g生药/kg云南分心木水提物外,其他各剂量组小鼠的心脏指数降低,有极显著性差异(P<0.01);28.40、23.57 g生药/kg的云南分心木水提物组和14.48、12.31、10.46、8.89 g生药/kg的新疆分心木水提物组小鼠的肝脏指数降低,有显著性差异(P<0.01或P<0.05);除13.47 g生药/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48和10.46 g生药/kg的新疆分心木水提物组外,其他剂量组小鼠的脾脏指数显著降低(P<0.05);所有剂量组小鼠肺脏和肾脏的脏器指数无显著变化。
2.5 分心木水提物对小鼠组织病理学的影响 由图1可知,与正常对照组对比,28.40、23.57 g生药/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48 g生药/kg的新疆分心木水提物会引起小鼠心肌纤维肿胀断裂和心肌出现肌溶性坏死,心脏颗粒性变性。28.40、23.57、19.56 g生药/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48 g生药/kg的新疆分心木水提物会引起肝脏细胞出现广泛溶解坏死。所有云南分心木和新疆分心木剂量组小鼠的脾脏、肺脏和肾脏组织均未见明显的病理变化。
3 讨论
实验结果表明,分心木并非完全无毒,云南和新疆分心木水提物剂量大于9.28 g生药/kg和6.43 g生药/kg时均可致昆明种小鼠出现死亡。两种分心木的LD50表明新疆分心木水提物毒性强于云南分心木水提物。就毒性作用的靶器官而言,利用脏器指数进行的初步评价结果表明,两种分心木急性毒性的靶器官既有相似性又有所差别。相同的毒性靶器官为心脏,两种分心木水提物几乎所有剂量组的小鼠均出现了心脏指数的下降,这可能是分心木对心脏的作用有一定的选择性,引起心肌细胞急性坏死甚至萎缩。两种分心木对于肝脏和脾脏的毒性在程度上则有一定的区别,云南分心木主要在高浓度时表现肝脏和脾脏指数的下降,而新疆分心木在所有受试浓度均引起两种脏器指数的下降,这可能是由于产地不同的两种分心木在化学成分与相对含量上有所差异所致[8]。对可能毒性靶器官的病理组织学检查结果显示,两种分心木水提物确实对心脏和肝脏产生了毒性作用,如引起心肌纤维断裂和心肌坏死,以及肝脏细胞的溶解,结果进一步明确了分心木的毒性靶器官和毒性类型。令人意外的是脾脏组织未见明显病理变化,说明上述分心木引起的脾脏指数下降可能未产生可见的器质性改变。
另一方面,实验中产生毒性的最小剂量(6.43 g生药/kg),标准体重成年人(60 kg)達到中毒剂量时需要分心木药材用量约为312 g(按小鼠到人剂量换算系数0.081[11]和提取率10%计算)。实际情况中单次药材用量根本不可能达到如此大的剂量(通常每次仅取10~20 g泡水或煎服)。因此,分心木在日常使用过程中通常不会出现急性中毒情况。至于两种分心木是否存在着慢性毒性尚不得而知,有待进一步研究验证。但民间应用分心木时需要谨慎,如果长期服用,需注意心脏和肝脏功能的异常症状。本实验取得的急性毒性数据可为分心木的合理使用提供指导,并为后续开展分心木慢性毒性研究提供参考依据。
参考文献
[1]全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编(上册)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2014.
[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草(第五卷)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 381.
[3]山西省卫生厅. 山西中药志[M]. 太原: 山西人民出版社, 1961.
[4]南京中医药大学. 中药大辞典(上册)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2005: 638.
[5]景援朝, 赵焕新, 白虹. 分心木的研究进展[J]. 药学研究, 2014, 33(3): 167-169.
[6]王丹, 董红敬, 郝翠, 等. 核桃分心木化学成分及抗炎活性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2018, 30: 1548-1553.
[7]王嘉佳, 高山, 何爱民, 等. 核桃分心木成分分析及其功能性研究进展[J]. 食品工程, 2019, (1): 12-17.
[8]孙冬雪, 马晓玲, 魏鸿雁, 等. 分心木中的木脂素类化学成分及其抗HIV活性研究[J]. 中草药, 2018, 49(17): 3992-3997.
[9]邓金龙. 我国核桃生产现状及发展策略[J]. 林产工业, 2016, 43(10): 56-58.
[10]孙蓉, 栾永福. 附子不同组分对疼痛小鼠的急性毒性实验比较研究[J]. 中国药物警戒, 2013, (10): 594-599.
[11]魏伟, 吴希美, 李元建. 药理实验方法学[M].4版.北京: 人民卫生出版社, 2010: 71.
(收稿日期:2019-05-15 编辑:陶希睿)