蓝莓根际土壤真菌多样性及根腐病拮抗菌的筛选

侯 瑞 王永灿 徐芳玲

( 贵州大学林学院，贵州 贵阳 550025)

蓝莓（Vaccniumsp.）为杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）多年生常绿或落叶灌木，具有很高的经济价值[1]。由丽赤壳属（Calonectria）、镰孢属（Fusarium）真菌引起的蓝莓根腐病是蓝莓主产区的重要病害。病原菌通过土壤进行传播，侵染蓝莓后可导致全株死亡[2-3]。贵州省蓝莓根腐病由尖镰孢菌（F. oxysporum）引起[4]，主要依靠传统的化学防治，对蓝莓果实品质会造成一定影响。因此，寻找环境中有益微生物是目前防治蓝莓根腐病的发展方向[5-6]。

土壤真菌多样性对植物的生长以及生态系统平衡等方面都起着重要作用[7-8]，植物根际土壤真菌多样性改变，会影响植物的抗病性[9]。不同植物根际真菌土壤间差异较大[10-11]，目前已有较多的根际土壤真菌用于生物防治，防治效果优于化学试剂[12-13]。本研究对蓝莓根际土壤进行分离培养，分析其多样性，同时筛选蓝莓根腐病拮抗真菌，为蓝莓根腐病生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

于2017年4—7月，选择贵阳麻江县蓝莓种植基地（东经 107°43′07″、北纬 26°25′49″）蓝莓发病区附近健康蓝莓植株，利用抖根法获得根际土壤样品，该基地蓝莓根腐病发生率为18.5%左右。根际土壤样品沿等高线分别设置5个样地（5 m×5 m），在各样方随机选择8株土壤样品采集[14]。土壤样品装入无菌袋，便携式低温保温箱中带回实验室，冰箱低温保存（4 ℃）。

1.2 根际土壤真菌的分离培养

1.2.1 供试培养基

蓝莓根际土壤真菌的分离和纯化采用马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、察氏培养基（Czapek）、马丁氏培养基（Martin）和孟加拉红培养基（PDAm）。

1.2.2 土壤真菌的分离培养

5个样地采集到的根际土壤等量混合作为供试土壤。采用平板稀释法，将土壤样品稀释至10-2倍，静置5 min后选取200 μL上清液在PDA、Czapek、Martin和PDAm中进行涂布，每种培养基设置10个重复。利用菌丝末端挑取法，分别挑取4种不同平板培养基中生长形态差异典型[15-16]的真菌菌株转接至PDA，28 ℃恒温培养箱（黑龙江东拓仪器有限公司，中国）培养，纯化3～5次。

1.3 真菌鉴定

1.3.1 土壤真菌的鉴定

使用CTAB提取法，并参考侯瑞[17]的方法提取土壤真菌DNA。利用真菌鉴定通用扩增引物ITS1和ITS4，土壤真菌菌株rDNA -ITS区段的PCR扩增、产物纯化参考王娜等[10]的方法，PCR扩增产物直接送测试公司切胶、纯化和测序。所有土壤真菌的测序片段修正后，利用NCBI数据库中BLASTN对测序序列进行对比分析。

根际土壤中每克干土中的真菌数量=菌落平均数×稀释倍数/干土质量(g)。按公式（1）～（3）计算Shannon-Wiener真菌多样性指数（H）、Pielou真菌均匀度指数（J）和Margalef丰富度指数（M）[18-19]。

式中：Pi为第i种的多度比例，S为属i所在根际土壤中属的数目，N为菌落数量之和。

1.3.2 蓝莓拮抗真菌鉴定

采用平板对峙法测定各分离菌株对蓝莓根腐病菌尖镰孢菌（贵州大学农学院植物病理学实验室提供）的抑菌活性。在无菌条件下，利用打孔器（6 mm）选取活化于PDA中的分离菌株和病原菌边缘新鲜菌丝，分别接种于90 mm PDA两侧，使得分离菌株和病原菌接种点直径相距50 mm，只在平板右侧接种病原菌为对照（CK）。设置3个重复，放置于28 ℃恒温培养箱（RH=40%）中培养7 d。测量CK病原菌菌落直径和处理组病原菌菌落直径，按公式（4）计算抑制率。

1.4 数据分析

根际土壤真菌多样性指数和抑菌率测定的数据采用Excel 2010和DPS v17.10软件进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 根际土壤真菌种类鉴定和分离频率

由表1可知，利用平板稀释法共分离获得的菌落形态具有明显差异的真菌80株。通过rDNAITS序列进行比对分析后发现，80株真菌分别隶属6个纲6个目11属51种，这些菌株与NCBI数据库中的已知真菌rDNA-ITS序列相似性都达到了99%和100%，同源性非常高。在分离得到的80株真菌中，青霉属（Penicillium）14种、木霉属（Trichoderma）13种、镰孢属（Fusarium）7种、孢球托霉属（Gongronella）5种，篮状菌属（Talaromyces）3种、拟青霉属（Purpureocillium）3种、毛壳属（Chaetomium）2种，毛霉属（Mucor）2种、曲霉属（Aspergillus）、粘帚霉属（Gliocladium）、拟小球壳孢属（Microsphaeropsis）各1种。其中，青霉属分离得到的菌株数量最多，为蓝莓根际土壤真菌群落的优势属，占菌株总数的27.50%。子囊菌门中，木霉属和镰孢属次之，均占菌株总数的16.25%。篮状菌属、毛壳属均占菌株总数的5.00%。粘帚霉属、拟青霉属和曲霉属分离得到菌株数相同，各占总菌株数的3.75%。小球壳孢属只分离得到1株，占总菌株数的1.25%。接合菌门的孢球托霉属分离得到13株，同样为优势属，分离频率为16.25%。毛霉属真菌分离得到2株，分离频率为2.50%。

表1 分离蓝莓根际土壤真菌的rDNA-ITS序列相似性分析Table 1 Similarity analysis of partial rDNA-ITS sequences from rhizosphere soil fungi isolates from Vaccnium sp.

续表1

续表1

由图1可知，不同培养基分离得到的真菌数量和真菌属的数量也不同。其中，PDA和PDAm分离得到的真菌数量为26株和19株，真菌属的数量最多，共8属。Czapek次之，分离到19株真菌、6个真菌属的类群。Martin分离得到16株真菌、5个真菌属，但其分离得到接合菌门孢球托霉属的真菌数量最多，其余培养基均是青霉属或木霉属的真菌数量最多。

图1 蓝莓根际土壤真菌菌群的分离频率Fig. 1 The isolation frequency of rhizosphere soil fungi from Vaccnium sp.

2.2 根际土壤真菌的多样性分析

由表2可知，蓝莓植株根际土壤中的真菌数量总数为2.96×105cfu/g，H为2.046 1，J为2.282 0，M为0.853 3。

表2 蓝莓根际土壤真菌多样指数Table 2 The diversity index of rhizosphere soil fungi of Vaccnium sp.

2.3 根际土壤真菌对蓝莓根腐病病原菌的抑制效果

由表3可知，TP1、TPM1、TM1、TC1等80个菌株与蓝莓根腐病病原菌在PDA中对峙培养7 d后，蓝莓根腐病病原菌菌落生长直径与CK直径差异均显著（P＜0.05）。其中，抑制率在50%以上的菌株有22株，抑制率在70%以上的有 8株，分别是 TP6、TP14、TP16、TPM3、TPM8、 TPM24、 TM11、 TM23。其 中 ，TPM8、TPM24和TM23均属于日本曲霉（Aspergillus japonicas），TP6、TP14、TP16、TPM3、TM11 则为木霉属真菌，棘孢木霉（Trichoderma asperellum）TM11明显抑制病原菌的生长，抑制率达到79.66%，长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）TP6，木霉属NECC40034TP14，盖姆斯木霉（Trichoderma gamsii）TP16，拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis）TPM3的抑制率也均为70%以上。蓝莓根腐病菌与6株土壤根际真菌对峙培养形成的菌落见图2，根际土壤真菌均抑制了病菌生长。

表3 蓝莓根际土壤真菌抑制效果Table 3 The inhibition effects of Vaccnium sp. rhizosphere soil fungi

续表3

图1 蓝莓根腐病菌与土壤根际真菌对峙培养形成的菌落Fig. 2 Colonies on dual-cultured plates between Fusarium oxysporum strain and rhizosphere soil fungi

3 结论与讨论

有关蓝莓根际土壤真菌研究的较少。虽然蓝莓为栽培种植，但了解蓝莓根际土壤真菌多样性对其土壤真菌种群特性研究具有重要意义。本研究从蓝莓根腐病发生区附近健康蓝莓根际土壤中分离得到的真菌，主要属于青霉属（27.50%）、木霉属（16.75%）、镰孢属（16.75%）、孢球托霉属（16.75%），篮状菌属（5%）、曲霉属（3.25%）和小球壳孢属（1.25%）等，与研究的其他物种根际土壤真菌相近[20-21]。蓝莓根际土壤真菌的优势属与其他物种根际土壤的优势种群相似，但在种群组成上存在一定差异，可能是由于蓝莓菌根菌的存在所致[22]。

蓝莓根际土壤中分离获得的80株真菌对蓝莓根腐病病菌抑制效果，抑制率在70% 以上的有8株，其中，3株均属于曲霉属，木霉属有5株。曲霉属真菌主要为工业用途，用于生防的研究并不多，但丛铭等[23]发现黑曲霉可以防治烟草青枯病。木霉属真菌主要用作生防，5株木霉分别鉴定为棘孢木霉、长枝木霉、盖姆斯木霉，拟康宁木霉和未知木霉属，已知的4种木霉都曾被报道用于生防，对三七灰霉病菌（Botrytis cinerea），花生菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum），立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖镰孢菌有很好的防治效果[24-27]。其次，本研究还发现金色毛壳属（Chaetomium aureum）TPM21、TP10、TP13菌株可以产生红色素，因为其生长速度较慢，所以抑制率并不高，但其产生红色素后，根腐病病原菌生长会被抑制，与滕怀丽[28]研究金色毛壳真菌具有抑菌活性相似，后期会做进一步研究。本研究通过对蓝莓根腐区附近健康蓝莓根际土壤真菌的分离、鉴定和筛选，获得了蓝莓根际生防真菌，但生防真菌如何大量定殖于蓝莓根部，使植株免遭病原菌侵染危害，是后期研究需要解决的问题。