肺感染大鼠肺泡灌洗液及血清中TNF-α、IL-6、IL-8 的水平及其临床意义

王 瑛，石书梅，殷 悦

细胞因子是机体多种细胞分泌的小分子多肽物质，调节和参与机体的生理功能，起传递细胞间信息的作用。在感染性疾病进程中，激活的单核细胞和肺巨噬细胞释放多种炎性因子，特别是TNF-α、IL-6、IL-8。随着感染时间的延长，细菌的数量和其他毒力因子释放量逐渐增加，也导致炎性因子的水平不断增加［1］，增高的炎性因子，部分吸收入血，使血清中及肺泡灌洗液炎性因子升高，该研究通过检测肺泡灌洗液及肺组织匀浆中细菌计数观察肺泡灌洗液及血清中各炎性因子水平来评价不同部位炎性因子对肺部感染急性发病期及定植期病情严重程度的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠24只，鼠龄8周，体重（180±20） g（解放军第 960 医院动物中心提供），随机分为正常对照组（下文简称对照组，8只）及流感嗜血杆菌感染组（下文简称感染组，16只）；后又将感染组随机分为灌洗液组 （8只）及血清组（8只）。

1.1.2 菌株 流感嗜血杆菌1709（解放军第960医院呼吸科临床分离菌株，并经VITEK系统鉴定）

1.2 方 法

1.2.1 模型制备 将大鼠以45 m/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉后，仰卧位固定于大鼠固定板，用电动剃毛器进行颈部、胸部脱毛，颈部适度过伸，暴露喉头，消毒，铺无菌洞巾，做颈部正中切口，约2～3 cm，分离颈前肌，暴露并固定气管，在环甲软骨处剪一V型切口，置入硅胶管（新生儿吸痰管6号），并将大鼠气管向右倾斜缓慢注入流感嗜血杆菌琼脂小珠 100 μl，完毕后将大鼠直立 10～20 s，使菌液尽量分布于右下肺。

1.2.2 标本采集 （1）支气管肺泡灌洗。大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉后，仰卧位固定于大鼠固定板，用电动剃毛器进行颈部剃毛，颈部适度过伸，暴露喉头，消毒，铺无菌洞巾，做颈部正中切口，钝性分离颈前肌，暴露并固定气管，在环甲软骨处剪一V型切口，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，刺入气管软骨环间隙，朝向心端进针约1 cm，回抽无阻力后，用温生理盐水10 ml灌洗3次，总回收率保持在 60%～90%。 BALF离心 7 min（3000 r/min），取上清，待测。（2）肺组织匀浆的制备。无菌取出一侧肺组织，用灭菌温生理盐水经支气管灌注冲洗5次，去除浮游菌，置于预先称重的无菌锡箔纸上，电子天平称重。组织块称重后，将右肺下叶肺组织剪碎，加入1 ml灭菌冰生理盐水，用已消毒的组织研磨器冰浴研磨成肺匀浆，离心7 min（3000 r/min），取上清，待测。（3）感染肺组织的活菌计数。无菌取出一侧肺组织，用灭菌温生理盐水经支气管灌注冲洗3次，去除浮游菌，后置于预先称重的无菌锡箔纸上用电子天平称重。组织块称重后，将右肺下叶肺组织剪碎，加人1 ml灭菌冰生理盐水，用已消毒的组织研磨器于4℃下研磨制成肺匀浆，用无菌的移液管取0.1 ml匀浆至0.9 ml的生理盐水中充分振荡混匀，再取0.1 ml至0.9 ml的生理盐水液中，依此类推将匀浆倍比稀释至106，分别取各浓度的匀浆0.1 ml用玻璃棒均匀涂布于MH琼脂平板上，每个浓度涂3个平板，将涂好的平板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育24 h，选取菌落在30～300个之间的平板进行菌落计数。每克肺组织中CFU数=菌落数×稀释倍数×100/肺组织重量。

1.2.3 检测指标 （1）肺部细菌学检查。观察大鼠肺泡灌洗液及肺组织匀浆细菌计数。（2）肺泡灌洗液及血清炎性介质的变化。观察对照组、感染组不同时间肺泡灌洗液及血清炎症因子水平的差异。在所有实验准备完成后，由于造模、打药等操作造成大鼠死亡，最终三组每组剩4只符合标准的大鼠。

1.3 统计学处理实验数据以（）描述。组间差异比较，定量资料采用单因素方差分析（One Way-ANOVA），实验数据均用SPSS 13.0统计软件分析。

2 结果

2.1 感染组菌落计数整个实验过程对照组肺组织未培养检出细菌。感染组肺泡灌洗液接种细菌当天菌落计数为（7.48±0.27） CPU/ml，第 1 天为（7.00±0.11） CPU/ml，第 4 天为（5.60±0.11） CPU/ml，第 8 天为（1.66±0.1） CPU/ml，第 15 天为（1.63±0.16） CPU/ml，第30天为0。感染组肺组织匀浆接种细菌当天菌落计数为（5.32±0.21） CPU/ml，第 1 天为 5.20 CPU/ml，第 4 天为（4.86±0.10） CPU/ml，第 8 天为（4.3±0.21） CPU/ml，第 15 天为（3.60±0.11） CPU/ml，第 30天为（3.95±0.26）CPU/ml。可见细菌计数在肺泡灌洗液及组织匀浆中第1天均为最高，肺泡灌洗液中4 d后下降明显，1个月后细菌未能检出，而在肺组织匀浆中，在第4天肺组织匀浆细菌数开始降低，与肺泡灌洗液结果一致，但仍至1个月时仍有细菌检出，且有上升趋势，提示有细菌定植。

2．2 肺泡灌洗液及血浆炎性介质的变化流感嗜血杆菌肺部感染大鼠细胞炎性因子在肺泡灌洗液及血清中变化见表1～3，各炎症指标肺泡灌洗液数值均高于血浆数值，TNF-α在感染大鼠肺泡灌洗液及血清中表达于第4天后数值逐渐下降，1 W趋于平稳，30 d时仍明显高于照组，有统计学意义；IL-6变化趋势中，感染大鼠在肺泡灌洗液及血清中数值同样于第4天开始明显上升，1 W时达到最高值后开始下降，其中灌洗液组在30 d时出现上升趋势与细菌计数一致，血清组持续下降。IL-8在感染大鼠肺泡灌洗液及血清数值均于第4天开始出现上升（与对照组比较有统计学意义），灌洗液组及血清组数值维持在一定水平未见明显下降，且30 d时出现上升趋势，与细菌计数一致。

3 讨论

感染可导致气道黏膜纤毛清除能力受损，降低纤毛清除能力，造成黏液分泌增加和呼吸道上皮受损，反过来又加速细菌在呼吸道的定植和感染，促进病原菌释放细菌内毒素、纤毛毒素和蛋白水解酶等细菌产物，导致前炎症细胞因子（IL-8，IL-6、IL-1、TNF-α）的释放和中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞在气道和肺实质的聚集和脱颗粒，造成肺实质损伤和进行性小气道闭塞，甚至引起组织的破坏，从而促进疾病的发生、发展［3］。因此在肺部感染性疾病的诊治中，如何及时分辨感染和定植是控制感染避免抗菌药过度治疗的重要因素。

表1 TNF-α在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的变化（pg/ml，）

表1 TNF-α在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的变化（pg/ml，）

注：与对照组比较，＊P<0.05（大鼠接种细菌当天为0天）。

组别 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天对照组 2.01±0.12 1.80±0.18 2.05±0.65 1.97±0.50 1.92±0.70 1.94±0.72血清组 1.43±0.19 3.37±0.39＊ 2.43±0.38＊ 2.43±0.58＊ 2.20±0.07＊ 2.00±0.72＊灌洗液组 1.98±0.09 4.02±0.15＊ 3.56±0.80＊ 3.16±0.80＊ 3.19±0.57＊ 3.25±1.20＊

表2 IL-6在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的变化（pg/ml，）

表2 IL-6在肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中的变化（pg/ml，）

注：与对照组比较，＊P<0.05（大鼠接种细菌当天为0天）

组别 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天对照组 91.5±11.32 90.30±21.20 89.70±23.56 93.20±26.5 92.00±10.20 91.43±0.15灌洗液组 389.7±46.15 1024.35±77.40＊ 530.82±68.54＊ 529.62±54.10＊ 706.89±78.75＊ 836.70±89.30＊血清组 92.3±20.19 184.10±26.12 164.60±22.40 157.30±24.10 144.80±1.01 116.70±1.10

表3 IL-8在肺部感染大鼠肺泡灌洗液中的变化（pg/ml，）

表3 IL-8在肺部感染大鼠肺泡灌洗液中的变化（pg/ml，）

注：与对照组比较，＊P<0.05（大鼠接种细菌当天为0天）。

组别 第0天 第4天 第6天 第8天 第15天 第30天对照组 0.72±0.12 0.72±0.18 0.80±0.65 0.76±0.50 0.72±0.70 0.82±0.72灌洗液组 1.63±0.19 5.86±0.12＊ 5.60±0.14＊ 4.40±0.18＊ 3.88±0.82＊ 4.00±0.70＊血清组 0.80±0.09 1.33±0.15 1.15±0.80 1.10±0.80 0.98±0.27 1.12±0.20

该实验研究发现，流感嗜血杆菌肺部感染大鼠肺泡灌洗液及血清中三种炎性因子数值均比对照组高，两组有显著性差异（P<0.05），提示流感嗜血杆菌感染后，由于菌体抗原及其胞外产物的刺激，首先导致机体免疫细胞（包括单核细胞）激活，产生大量TNF-α、IL-8，参与机体的炎症反应和免疫应答，在循环中出现并迅速达到高峰，进而诱发IL-6产生，并由此激发炎症连锁反应。通过检测各组大鼠肺泡灌洗液和血浆中TNF-a、IL-6、IL-8水平结合菌落计数结果，该研究发现当肺泡灌洗液中细菌数增高时三种细胞炎性因子水平均较高，且肺泡灌洗液远高于血清水平，提示急性炎症与炎性因子呈正相关。在感染组肺泡灌洗液中菌落计数在第30天时细菌数为0，提示急性感染清除；而肺泡灌洗液及血清中细胞炎性因子数值虽均有所下降，但并未恢复到对照组水平，结合肺组织匀浆菌落计数显示，虽然浮游菌被清除但仍有少量细菌定植在肺内，考虑炎性因子仍高于对照组与肺内定植细菌不断释放内毒素、蛋白水解酶等有关，但数值水平较低，在接种细菌1个月时肺泡灌洗液中IL-6及IL-8出现上升趋势，同时期肺组织匀浆菌落计数显示细菌数量有上升趋势，分析与肺内细菌数即炎症程度与炎性因子水平呈正比，而血清中此现象表现并不明显，考虑与血浆中浓度比肺泡灌洗液低有关。提示炎性因子可作为评价感染程度的指标，同时也是细菌在气道内定植的提示。

不同的疾病由于病因不同，对机体的免疫和非免疫细胞的刺激不同，激发机体免疫反应产生的炎症介质种类、细胞因子含量改变也不一定相同，这也同时说明了细胞因子之间存在着特殊复杂的网络交叉关系，而且在不同部位其浓度不同，肺泡灌洗液作为肺部疾病诊断的一种辅助方法越来越受到重视，有研究显示支气管哮喘患者肺泡灌洗液炎性因子水平可作为检测病情程度及评价疾病转归的指标［4］，其中对于曲霉菌的诊断发现肺泡灌洗液比血浆更为灵敏［5］。但如何根据临床诊治的需要更好地选择检测指标及方式，还需进一步研究证实。