生防菌HFW217的鉴定及其对棉花枯萎病的防治效果

丁建朋，范瑛阁，姚永生

(塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔，843300)

0 引 言

【研究意义】2017年新疆棉花种植面积196.3×104hm2，总产量408.2×104t，分别占全国的60.8%和74.4%[1-2]。由于大面积种植以及多年连作，棉花枯萎病发生日益严重，而长期借助多菌灵、百菌清等进行化学防治，致使病原菌抗药性不断提高，防控越来越困难，也对环境造成了污染[3-5]，严重制约着新疆棉花的可持续发展。筛选对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的微生物，对棉花枯萎病的生物防治具有重要意义[6]。【前人研究进展】生物防治因其对环境友好、人畜安全性高及作用靶标专一性强等优点，是目前生产中较为安全有效的防控措施，利用拮抗微生物进行生物防治符合保护生态环境的需求，为农业有害生物绿色防控和可持续发展提供技术保障[7]。具有拮抗作用的微生物在维持土壤微生物群落结构平衡中起着重要作用，已报道对尖孢镰刀菌有拮抗作用的微生物主要有木霉菌Trichodermaspp.、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis等[6,8-10]，其中木霉菌防治棉花枯萎病取得了良好的防效。【本研究切入点】应用拮抗微生物对防治病害可有效减少农药对环境的污染，是极具潜力的发展方向[11-12]。研究分离筛选对棉花枯萎病有抑制作用的微生物，并进行鉴定。【拟解决的关键问题】研究以一株南疆半沙漠化、半盐碱化环境中分离的生防菌HFW217为目标，通过16S rDNA和生理生化方法，对其进行鉴定，并测定其对棉花枯萎病的温室和田间药效，可为防控棉花枯萎病的生物农药开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 生防菌

生防菌HFW217，从阿拉尔周边长势良好的棉田植株根际土壤中分离而来。

1.1.2 试剂

DNA Marker、Goldview I型核酸染料、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒及2×EsTaqMasterMix分别购自北京康为世纪生物科技有限公司、北京索莱宝科技有限公司和上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 引物

细菌16S rDNA扩增参考采用通用引物27F/1492R；芽孢杆菌rpoB基因特异性引物按照引物设计原则以Genbank中6株标准芽孢杆菌rpoB基因组序列为参考，试验引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)。表1

表1 鉴定所需PCR引物序列

Table 1 PCR primers used for species identification

目标基因Target gene引物Primer核苷酸序列Nucleotide sequence 5’-3’16S rDNA27FAGAGTTTGATCCTGGCTC1492RCGGCTACCTTGTTACGACTTrpoBHr-fAGGTCAACTAGTTCAGTATGGACHr-rAAGAACCATAACCGGCAACTT

1.1.4 供试棉花

供试棉花：品种围为新陆中54号。

对照药剂：80%多菌灵WP(石家庄亚润科技发展有限公司生产)，按照使用说明配制1 500倍液。

1.1.5 发酵液与发酵液的制备

生防菌发酵液为LB培养基不加琼脂，将HFW217在发酵液中28℃，12/24 h光照培养24 h后，按1∶20的比例再次接种到发酵液中28℃，180 rpm/min，振荡培养4 d备用。

1.2 方 法

1.2.1 生防菌HFW217的生理生化测定

生防菌HFW217的生理生化鉴定包括培养性状、生理和生化测定三个方面，利用扫描电镜对菌株形态和大小进行测定，其它指标参考《常见细菌系统鉴定手册》[13]中记载的方法进行。

1.2.2 生防菌HFW217的16S rDNA分子序列测定

1.2.2.1 细菌基因组DNA提取

改良酚氯仿法；从新鲜培养物中刮取足量的菌体于离心管中，加入200 μL 10×TE和20 μL 50 mg/mL溶菌酶溶解，于37 ℃ 180 rpm条件下恒温摇床震荡4 h，至酶解彻底。取出后加入20% SDS 50 μL、蛋白酶K(20 mg/mL)5 μL ，60℃条件下水浴2 h，取出后加入1/10体积CTAB/NaCl，并补加5 mol/LNaCl至终浓度0.5 mol/L，混匀后等体积加入氯仿/异戊醇，12 000 r/min离心10 min，取上清置新离心管加1/10体积的3 mol/LNaCl，再加2倍体积的预冷无水乙醇，于-20℃条件下沉淀DNA过夜，取出后12 000 r/min离心10 min，倒去上清，加入70%冰乙醇洗涤2～3次，干燥后加入100 μL 10×TE重新溶解，置于-20 ℃条件下保存。

Ezup柱式法：方法采用改进的SDS-CTAB法。基因组DNA提取参照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书操作进行，对提取后的基因组DNA用10×TE溶解后，置于-20℃条件下保存。

1.2.2.2 聚合酶链式反应(PCR)

向无菌PCR管内加入25 μL PCR mastermix，4 μL模板，上下游引物各2 μL，并补足ddH2O，制成50 μL PCR体系。PCR反应设阳性对照PCR管1支，空白(阴性)对照1支，待测样品2支。

PCR扩增条件为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min，52℃引物复性90 s，72℃延伸3 min，共进行35个重复，最后72℃延伸10 min[19]。

1.2.2.3 PCR结果的电泳检测

用1×TAE配置1%琼脂糖凝胶，溶后待冷却至不烫手时(约55℃)加入goldview II 染色剂至终浓度为0.5‰，制胶。将凝固完全的胶放入电泳槽，使电泳液高出凝胶约1 mm，进行点样，点样完成后于110 V恒压电泳35 min，取出后置于凝胶成像系统下进行拍照。

1.2.2.4 16S rDNA序列分析及系统发育树绘制

对PCR产物进行测序，利用BLAST软件对测序获得的16S rDNA序列与Genbank数据库进行比对分析，并在Clustal X(1.8)程序中对相近序列进行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析，用Neighbor-Joining法构建基于16S rDNA的系统发育树。

1.2.3 生防菌HFW217温室和田间防效测定

温室试验在塔里木大学植保站温室中进行。选取长势一致的棉花苗在两叶一心期接种棉花枯萎病菌，待棉花叶片出现零星病斑时开始喷药。每隔7 d喷药一次，共喷药3次，在第一次喷药之前和最后一次喷药后7 d统计病情指数。调查分级标准和防治效果，计算方法参照参考文献[14]。计算结果用DPS数据处理系统分析5%水平的差异显著性。田间防效试验设在塔里木大学植物保护试验田，处理及数据分析参照温室试验。

2 结果与分析

2.1 生防菌HFW217的生理生化测定

2.1.1 菌落形态

HFW217菌株在LB上的菌落形态显示，菌落隆起有皱褶，淡黄色不透明，粘稠有臭味，无水溶性色素，单菌落形态为近圆形。图1

图1 HFW217在LB培养基上的培养形状

Fig.1 Culture shape of HFW217 on LB medium

图2 HFW217扫描电镜图片

Fig.2 Scanning electron microscopy picture of HFW217

2.1.2 菌体形态与大小

HFW217菌株的菌体形态为短杆状，大小为(0.5～0.8)×(1.1～3.0)μm。图2

2.1.3 生理测定

HFW217芽孢呈椭圆形，着生于菌体中部，无鞭毛，革兰氏染色为阳性菌，可耐受45℃的高温和15℃的低温；HFW217在无盐状态以及11%盐浓度下均可生长。HFW217在葡萄糖为碳源的培养基中生长优于以甘露醇为碳源的培养基，在硝酸钾、硝酸铵，草酸铵为氮源的培养基中均生长不良。表2，表3

表2 HFW217生长温度

Table 2 Growth temperature of HFW217

温度Temperature/℃HFW21710﹣15﹢25﹢28﹢35﹢40﹢45﹢50﹣55﹣

注：，阳性反应；-，阴性反应

Note:, positive reaction; -, negative reaction

表3 HFW217的耐盐性试验

Table 3 Salt tolerance test of HFW217

NaCl的质量分数Mass fraction of NaCl/(%)HFW2170﹢2﹢5﹢7﹢10﹢11﹢12﹣

注：，阳性反应；-，阴性反应

Note:, positive reaction; -, negative reaction

2.1.4 生化鉴定

研究表明，硝酸盐还原和过氧化氢酶均为阳性，葡萄糖发酵产酸，水解淀粉、明胶，pH 6.8和pH 5.7下均能生长，不产生吲哚，不水解卵磷脂，不形成二羟基丙酮，孢囊膨大，不能水解酪素，不能利用柠檬酸盐，能发酵L-阿拉伯糖、D-木糖和甘露醇。

结合《常见细菌系统鉴定手册》，HFW217与解淀粉芽胞杆菌的描述最相近，鉴定为解淀粉芽胞杆菌。表4

表4 HFW217生化测定

Table 4 Biochemical test results of HFW217

特征 CharacteristicHFW217特征 CharacteristicHFW217细胞直径>1.0 μmCell diameter>1.0 μm﹣卵黄卵磷脂Yolk lecithin﹣芽孢形状Spore shape椭圆明胶液化Gelatin liquefaction﹢孢囊膨大Cyst enlargement﹢利用柠檬酸盐Utilization of citrate﹣过氧化氢酶实验Catalase experiment﹢L-阿拉伯糖L-pectinose﹢硝酸盐还原Nitrate reduction﹢甘露醇Mannitol﹢产生吲哚Indole production﹣发酵D-葡萄糖Fermentation of D-glucose﹢脲酶实验Urease experiment﹢D-木糖D- xylose﹢水解淀粉Hydrolyzes starch﹢生长PH: 6.8 营养肉汤Growing PH: 6.8 nutritional broth﹢酪素水解Casein hydrolysis﹣生长PH: 5.7 营养肉汤Growing PH: 5.7 nutritional broth﹢

注：，阳性反应；﹣，阴性反应

Note: +, positive reaction; -, negative reaction

2.2 HFW217的基因检测

2.2.1 HFW217的PCR扩增产物电泳检测

经电泳检测16S rDNA大小在1 400～1 600 bp(图3a)，对上海生工测序结果读图和拼接后得16S rDNA序列1 455 bp。采用芽孢杆菌特异性rpoB引物扩增在500～600 bp范围内有扩增产物(图3b)，对上海生工测序结果读图后得rpoB基因序列557 bp。图3

2.2.2 16S rDNA序列比对与同源性

HFW217菌株16S rDNA基因序列与47株芽孢杆菌科细菌相似性在91%以上。相似性在92.36%～99.72%的有43株，均为芽孢杆菌属；2株为枝芽孢杆菌属，相似性为93%；1株为耐盐短杆菌，相似性为98.90%；株为乳杆菌属，相似性为91.67%。序列相似性大于95%和97%的菌株除一株耐盐短杆菌外，其余均为芽孢杆菌属细菌。16S rDNA基因序列相似性位列前三的分别为甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌。列出序列相似性>95%的结果。表5

图3 PCR扩增产物的电泳结果(1%琼脂糖凝胶)

Fig.3 The result of electrophoresis for PCR amplification products with 1% agarose gel

表5 HFW217菌株16S rDNA序列比对

Table 5 The alignment for 16S rDNA of strain HFW217

序号Rank名称Name菌株编号Strain登录号Accession相似性Similarity(%)1Bacillus methylotrophicusCBMB205(T)EU194 89799.722Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarumFZB42(T)CP000 56099.453Bacillus siamensisKCTC13 613(T)AJVF01 000 04399.384Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciensDSM7(T)FN597 64499.115Bacillus subtilis subsp. subtilisNCIB3 610(T)ABQL01 000 00199.116Brevibacterium halotoleransDSM8 802(T)AM747 81298.907Bacillus atrophaeusJCM9 070(T)AB021 18198.908Bacillus vallismortisDV1-F-3(T)JH600 27398.839Bacillus mojavensisRO-H-1(T)JH600 28098.8310Bacillus subtilis subsp. spizizeniiNRRLB-23 049(T)CP002 90598.7611Bacillus licheniformisATCC14 580(T)AE017 33397.5912Bacillus aerius24K(T)AJ831 84397.3813Bacillus stratosphericus41KF2a(T)AJ831 84196.8414Bacillus aerophilus28K(T)AJ831 84496.8415Bacillus pumilusATCC7061(T)ABRX01 000 00796.5616Bacillus vietnamensis15-1(T)AB099 70895.6417Bacillus aquimarisTF-12(T)AF483 62595.3218Bacillus acidicola105-2(T)AF547 20995.1119Bacillus marisflaviTF-11(T)AF483 62495.0520Bacillus shackletoniiLMG18 435(T)AJ250 31895.04

2.2.3 rpoB基因的序列比对与同源性

HFW217菌株rpoB基因序列比对相似性大于91%的有101株，其中97%的菌株提示为芽孢杆菌属。基因相似性大于97%的菌株除2例提示为枝芽孢杆菌属，相似性在99.4%～99.6%以外，其它显示均为芽孢杆菌属菌株，其中解淀粉芽孢杆菌及其亚种、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌出现较多。序列相似性100%的9株菌株中8株为解淀粉芽孢杆菌及其亚种，1株为芽孢杆菌属，其分类学尚不明确。

2.2.4 16S rDNA基因系统发育树

研究表明，从遗传进化关系上，HFW217与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌等共属一个进化分支。经1 000次重复检验中，一致的分支数值均不足70[11]，不能从16S rDNA角度判断HFW217具体为解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌等其中哪一种。对HFW217菌株16S进化树中出现的菌株分别进行分子钟检验，发现与HFW217菌株16S rDNA基因处于同一进化分支上的各菌株经χ2检验P>0.05，均能接受具有相同分子进化速率的假说。图4

2.2.5 rpoB基因系统发育树

从NCBI数据库下载的同源性高于97%的菌株rpoB基因，构建Neighbour-Joining Tree。HFW217与解淀粉芽孢杆菌处于同一进化分支，并且与两株解淀粉芽孢杆菌普鲁兰酶亚种Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum具有相同的进化距离。与HFW217同样具有相同进化距离的一株枯草芽孢杆菌916菌株，从分子进化角度也靠近解淀粉芽孢杆菌。结合两个进化树分析，菌株HFW217可能与当前农业生防已广泛应用的解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株[11]有更近的物种关系。在对HFW217与其rpoB基因进化树中出现的菌株进行分子钟检验，其中唯一差异位点数最少的为与HFW217处于同一进化分支的三株菌株，经χ2检验可以接受HFW217与解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌具有相同分子进化速率的假设。其中经检验得HFW217与解淀粉芽孢杆菌UCMB5113和FZB42在卡方检验中P=1接受具有相同分子速率的假设。图5

图4 HFW217菌株16S rDNA基因系统发育树(临位连接法)

Fig.4 Phylogeny tree for 16S rDNA of strain HFW217 (Neighbour-joining)

图5 HFW217菌株rpoB基因系统发育树(临位连接法)

Fig.5 Phylogeny tree for rpoB gene of strain HFW217 (Neighbour-joining)

2.3 生防菌HFW217对棉花枯萎病的温室和田间防效

研究表明，菌株HFW217对棉花枯萎病的预防效果可达81.80%，治疗效果为74.62%，预防效果高于发病后的治疗效果；而田间试验菌株HFW217对棉花枯萎病的预防效果80.97%，治疗效果为73.18%，预防效果也高于发病后的治疗效果。与对照药剂多菌灵相比，生防菌HFW217的预防效果和治疗效果均较为显著。表6，表7

表6 生防菌HFW217对棉花枯萎病的温室防治效果

Table 6 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in greenhouse

处理Treatment预防 Prevention治疗 ControlHFW217多菌灵Carbendazim无菌水Sterilized waterHFW217多菌灵Carbendazim无菌水Sterilized water处理前病指Pre-treatment disease index---15.3315.3515.47处理后病指Post-treatment disease finger13.8817.3676.2821.6524.4185.79防治效果Control efficiency81.80a77.24b-74.62c66.75d-

表7 生防菌HFW217对棉花枯萎病的田间防治效果

Table 7 The biological control efficacy of the strain A13 against cotton Fusarium wilt in field

处理Treatment预防 Prevention治疗 ControlHFW217多菌灵Carbendazim无菌水Sterilized waterHFW217多菌灵Carbendazim无菌水Sterilized water处理前病指Pre-treatment disease index---16.3616.8316.71处理后病指Post-treatment disease finger15.6721.7782.3623.3125.8988.34防治效果Control efficiency80.97a73.57b-73.18b70.97c-

3 讨 论

结合生理生化和16S rDNA以及rpoB基因序列比对和遗传进化分析，认为菌株HFW217属于解淀粉芽孢杆菌，从基因水平分析，HFW217的亲缘关系上可能与解淀粉芽孢杆菌普鲁兰酶亚种的亲缘关系最近。通过生理试验测定，发现这株解淀粉芽孢杆菌能够在盐浓度为11%和45℃培养条件下生长，比较符合HFW217来源于南疆盐碱土壤的生活环境，也比较容易在南疆田间环境发挥生防作用。通过温室和田间试验分析，HFW217对棉花枯萎病防效显著。

与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及甲基营养型芽孢杆菌等多个芽孢杆菌相比，菌株HFW217的16S基因序列相似性极高，在分类学上很难将其区分。与耐盐短杆菌在基因序列上也存在很高的相似性，通过早期对菌株HFW217的形态学和生理生化的研究发现HFW217是一株产芽孢革兰阳性细菌，可以与不产芽孢的耐盐短杆菌区分开。HFW217菌株的rpoB基因较16S rDNA序列相似性更高，最高达到100%，从rpoB基因进化距离估算和进化树分析，菌株HFW217 与解淀粉芽孢杆菌具有稳定一致的分子进化关系[15]。虽然从NCBI数据库中下载的BucillussubtilisStr.916在NCBI数据库分类为枯草芽孢杆菌，但综合rpoB基因进化树结果可以看出，枯草芽孢杆菌916菌株分子进化关系也更靠近解淀粉芽孢杆菌，这与欧洲数据库(ezGenome)提示的分类学关系一致。从rpoB基因进化情况还可以判断，HFW217与甲基营养型芽孢杆菌相比具有更长的进化距离，从进化角度可以排除HFW217为甲基营养型芽孢杆菌。其他在两种基因比较和进化分析选择中并未同时出现的菌种和菌株无法更详细判断种间进化关系远近。

对于芽孢杆菌近缘种间鉴定仅从序列的相似性较难判断亲缘关系，必要时需要结合形态学的观察，如该例鉴定中对耐盐短杆菌的排除。其次，16S rDNA基因序列在对芽孢杆菌属内近缘种间关系的判断并不如rpoB基因对这种近缘种关系判断具有更大的贡献，这与基因分子中种的基因独特性相关。从进化的估计来看，16S rDNA序列过于保守，序列系统发育树分支冗余，在亲缘较近的种，如解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等表现出的进化距离相同，给种的鉴定增加了较多不确定性。相比16S rDNA基因，rpoB基因虽然具有更大基因分子独特性，但难以寻找如16S rDNA扩增使用的通用引物，需要针对特定属或若干种进行引物设计。

由于芽孢杆菌产芽孢的特性，这成为研究之前其他形态学和生理生化研究工作区分芽孢杆菌与非芽孢杆菌的主要依据，而生理生化和形态学研究并不能直接具体确定芽孢杆菌属具体的种，这主要与芽孢杆菌近缘种具有极相似的生理生化特性相关。研究方法中16S rDNA基因的研究为选择特异性的引物提供了主要参考依据，而单独对于芽孢杆菌16S rDNA在芽孢杆菌近缘种中的鉴定贡献并不明显。研究原计划从16S rDNA、rpoB、gyrB三个基因着手开展鉴定工作并比较三个不同基因区段对于细菌鉴定的贡献，但gyrB基因的扩增一直未能设计筛选出合适的引物，从国内外研究的比较中可以得出gyrB基因对于细菌鉴定的敏感性可能不如rpoB基因，但从芽孢杆菌已知菌株gyrB基因区域中单核苷酸多态性较丰富的表现，gyrB基因可能在芽孢杆菌近缘种的鉴定中具有较大贡献。gyrB基因和rpoB基因利用其单核苷酸多态性的特性在鉴定工作中的贡献在国内外其他临床微生物的研究中贡献也有体现，如诺卡氏菌种[16]。进化分析对基因序列的比对分析使用的MEGA6.06较MEGA5.0除了继承之前的算法以外，在进化距离估计和相关性的分析提供更多的便利以及引入科学统计学算法直观呈现统计学相关性分析结果比较同一进化分支和不同进化分支的关系[17]。

解淀粉芽孢杆菌对多种植物病害都有一定的抑制作用，是一类重要具有生物防治作用的芽孢杆菌，例如对香蕉枯萎病[18]、油菜核盘菌[19]、尖孢镰刀菌[6]、草莓蛇病菌[20]、大花惠兰根腐病[21]、辣椒疫霉[22]、水稻细菌性条斑病[23]、马铃薯枯萎病菌和炭疽病菌[24]、大豆根腐病[25]、炭疽病[26]等都有不同程度的抑制作用。目前，解淀粉芽孢杆菌作为农药中的杀菌剂已在生产中应用，陕西加伦多生产的10亿活芽孢/克可湿性粉剂被登记用于防治水稻稻瘟病[27-28]。研究中，解淀粉芽孢杆菌对棉花枯萎病的温室和田间防效显著，与以往研究不同的是，解淀粉芽孢杆菌HFW217从南疆半沙漠化、半盐碱化生态环境中分离而来，能够耐受新疆干旱、盐碱和寒冷等自然条件，具有抗逆特性。

4 结 论

与多个芽孢杆菌相比，HFW217菌株的16S rDNA基因序列与43株芽孢杆菌科细菌相似性92.36%～99.72%；而16S rDNA进化关系上，菌株HFW217与枯草芽孢杆菌、西姆芽孢杆菌等在分类学上也很难区分。HFW217菌株的rpoB基因较16S rDNA序列相似性更高，序列相似性100%的9株菌株中8株为解淀粉芽孢杆菌及其亚种，1株为芽孢杆菌属。采用16S rDNA、rpoB基因序列和生理生化结合的方法对HFW217进行鉴定，其结果是该生防菌是解淀粉芽孢杆菌B.amloliquefaciens。菌株HFW217在温室和田间对棉花枯萎病的预防效果为81.80%和80.97%，防治效果分别为77.62%和73.18%，均明显高于对照药剂，具有潜在的应用价值。