沙眼衣原体通过诱导IL-10抑制炎症因子产生①

杜 昆 曹昌柏

(湖北省荆州市第一人民医院输血科，荆州434000)

病原微生物入侵机体后，机体免疫细胞可产生多种促炎症细胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，并引起机体的炎症反应，其结果不利于病原体的存活[1]。然而，某些病原体能通过诱导机体免疫细胞产生抗炎症细胞因子而抑制机体的免疫反应，如IL-10，从而导致病原体在机体内长期存活[2,3]。IL-10主要通过JAK/STAT(Janus Kinase/signal transducer and activator of transcription)信号通路发挥作用，首先IL-10与其受体IL-10 R1结合并激活JAK1与TyK2，激活的JAK1磷酸化IL-10 R1的两个酪氨酸残基Y446 与Y449，磷酸化的两个酪氨酸残基即成为STAT3的锚定位点，转录因子STAT3通过其SH2区域与这些部位相结合并被激活，然后STAT3形成二聚体转入细胞核内结合到启动子相关的STAT结合元件上选择性地抑制或启动基因的转录。

有文献报道某些病原微生物能通过激活机体的某些信号通路诱导IL-10的表达[2-4]。而沙眼衣原体作为一种严格细胞内寄生的病原体，其整个生活周期都依赖于宿主细胞，并对宿主的多条信号通路产生影响[5-8]。 衣原体感染人外周血单个核细胞后能诱导IL-10的产生[9,10]；此外，Yilma等[11]报道外源性IL-10能抑制沙眼衣原体感染细胞促炎症细胞因子的产生，但其机制如何以及衣原体感染诱导的内源性IL-10是否有相同的作用尚不知晓。本课题旨在探讨内源性IL-10对衣原体感染人外周血单个核细胞促炎症细胞因子产生的影响及其机制，为防治衣原体感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 RPMI1640细胞培养基购自Invitrogen公司，小牛血清购自杭州四季青公司，抗人IL-10抗体购自R&D公司，人IL-10、IL-6和TNF-α ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，化学抑制剂Ruxolitinib购自博欧特生物科技有限公司，ECL发光试剂盒购自Pierce公司。

1.2方法

1.2.1沙眼衣原体增殖 将 HeLa229 细胞接种到50 cm2细胞培养瓶中，细胞长成单层 75%融合后，弃培养基，加沙眼衣原体L2悬液，2 h 后弃上清，更换衣原体生长液(含10%胎牛血清和2 mg/L放线菌酮)，48 h后收集细胞并重悬细胞沉淀，37℃水浴与-80℃反复冻融3次，1 000 r/min离心8 min，上清即为衣原体悬液，分装后-80℃保存备用。

1.2.2外周血单个核细胞的制备和沙眼衣原体的感染 抽取健康志愿者外周血10 ml注入50 ml离心管中，加入10 ml PBS并轻轻混匀；取15 ml 离心管两支，加入Ficoll溶液5 ml，再将10 ml稀释的血液轻轻加入两支15 ml离心管中，2 000 r/min，20 min；用吸管将白色细胞层吸取到另一15 ml离心管中，加入PBS至10 ml，1 500 r/min，10 min，去掉上清，反复操作3次；加入5 ml含10% 胎牛血清的RPMI1640 培养基重悬细胞，进行细胞计数并接种到96孔板中，每孔5×104个细胞，加入3 MOI或如实验所示不同滴度的沙眼衣原体悬液作为感染组，同时设立未感染衣原体组作为对照组，37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.3ELISA双抗体夹心法检测细胞因子 取细胞培养液上清到无菌试管中，3 000 r/min，10 min，除去细胞碎片和杂质，取上清，-20℃保存，待所有标本收齐后用ELISA双抗体夹心法检测上清细胞因子IL-10、IL-6和TNF-α含量。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4Western blot实验 提取细胞总蛋白，取100 μg 蛋白样品加入到等体积的2×SDS样品缓冲液中，于沸水中加热5 min，冷却后立即加样；4℃、120 V电压电泳4 h左右；电泳结束后，将蛋白条带转移至PVDF(Polyvinylidene fluoride)膜中，4℃、80 V 转移2 h；转膜完成后，取出PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加入特异性的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，每遍10 min；加入HRP标记的二抗IgG，室温孵育1 h，然后TBST洗膜3遍，每遍10 min，TBS洗膜3遍，10 min，最后用ECL发光试剂盒发光显影。

2 结果

2.1沙眼衣原体诱导外周血单个核细胞IL-10产生 如图1A所示，外周血单个核细胞在沙眼衣原体感染下，IL-10分泌增加，且随沙眼衣原体感染滴度的增加，产生IL-10的量也逐渐增多。图1B所示，3 MOI衣原体感染后8 h IL-10的产生量明显增加，且随着感染时间的延长，产生IL-10的量也逐渐增多，在48 h达到顶峰，然后下降。不同滴度的衣原体感染组和3 MOI感染8 h后各时间点的IL-10产生量与对照组比较差异均有统计学意义(t=8.342、9.631，均P<0.05)。

2.2内源性IL-10对IL-6和TNF-α分泌影响 如图2所示，在沙眼衣原体的作用下，外周血单个核细胞IL-6和TNF-α产生量均增多，但当加入抗人IL-10抗体时，细胞IL-6和TNF-α产生量明显增多，与沙眼衣原体感染但未加抗人IL-10抗体组比较，IL-6和TNF-α的表达差异均有统计学意义(t=10.326、11.231，均P<0.05)。

图1 沙眼衣原体诱导外周血单个核细胞IL-10分泌Fig.1 Chlamydia trachomatis induces IL-10 secretion in peripheral blood mononuclear cellsNote: *.P<0.05.

图2 抗IL-10抗体上调沙眼衣原体感染细胞IL-6和TNF-α分泌Fig.2 Anti IL-10 antibody increases IL-6 and TNF-α secretion in Chlamydia trachomatis infected cellsNote: *.P<0.05.

图3 抗IL-10抗体抑制沙眼衣原体感染细胞STAT3蛋白磷酸化Fig.3 Anti IL-10 antibody inhibits STAT3 protein phosphorylation in Chlamydia trachomatis infect-ed cells

图4 抑制STAT3蛋白磷酸化导致IL-6和TNF-α分泌增多Fig.4 Inhibition of phosphorylated STAT3 expression increases production of IL-6 and TNF-αNote: *.P<0.05.

2.3内源性IL-10对STAT3蛋白活性影响 如图3A所示，外周血单个核细胞在沙眼衣原体感染下，STAT3蛋白发生磷酸化，且随沙眼衣原体感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐渐增多，呈剂量依赖性。图3B所示，当感染细胞中加入抗人IL-10抗体时，磷酸化的STAT3蛋白明显减少。

2.4STAT3蛋白对IL-6和TNF-α产生影响 如图4A所示，1 μmol/L化学抑制剂Ruxolitinib能明显抑制沙眼衣原体感染细胞STAT3蛋白的磷酸化。在1 μmol/L化学抑制剂Ruxolitinib作用下，沙眼衣原体感染的外周血单个核细胞产生的IL-6和TNF-α明显增多，与沙眼衣原体感染的未加抑制剂处理的细胞组相比，IL-6和TNF-α的表达差异均有统计学意义(t=12.301，P<0.05，图4B)。

3 讨论

抗炎症细胞因子IL-10在病原体入侵时对机体的免疫应答起到重要的调节作用[12]。以往的研究证实衣原体能诱导单核-巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞等产生IL-10[13-16]。此外，IL-10能通过抑制促炎症细胞因子的产生而抑制机体的免疫功能，从而有利于衣原体在机体内存活[17]。这些结果表明，衣原体能通过诱导IL-10的表达而抑制促炎症细胞因子的产生，从而降低机体的免疫反应，有利于衣原体在机体内长期存活。然而，衣原体诱导产生的内源性IL-10抑制炎症细胞因子产生的机制尚不清楚。

本研究表明，外周血单个核细胞在沙眼衣原体感染后8 h，IL-10分泌明显增加，在48 h达到顶峰，然后下降；此外，随着感染滴度的增加，产生的IL-10也逐渐增多，呈剂量依赖性。有研究表明外源性IL-10能抑制炎症因子IL-6和TNF-α的产生[11]，但内源性IL-10是否有相同的功能尚不知晓。本研究表明，沙眼衣原体感染的外周血单个核细胞产生较多的IL-6和TNF-α，但当加入抗人IL-10抗体时，细胞IL-6和TNF-α分泌量明显增多，表明沙眼衣原体诱导产生的内源性IL-10也有抑制炎症因子产生的功能。由于IL-10主要通过活化STAT3蛋白发挥作用，为证实STAT3蛋白是否参与IL-10抑制衣原体感染细胞炎症因子的产生，我们首先检测IL-10是否活化STAT3蛋白。结果表明，外周血单个核细胞在沙眼衣原体感染下，STAT3蛋白发生磷酸化，且随着感染滴度的增加，磷酸化的STAT3蛋白也逐渐增多。但当感染细胞中加入抗人IL-10抗体时，磷酸化的STAT3蛋白明显减少，表明沙眼衣原体是通过诱导IL-10表达而活化STAT3蛋白。为进一步证实IL-10抑制炎症因子产生的功能是否与其活化STAT3蛋白有关，我们用化学抑制剂Ruxolitinib抑制沙眼衣原体感染细胞STAT3蛋白的磷酸化。结果表明，在化学抑制剂Ruxolitinib作用下，沙眼衣原体感染的外周血单个核细胞分泌的IL-6和TNF-α明显增多，提示IL-10可能通过活化STAT3蛋白抑制炎症因子的产生。

有文献报道，剔除IL-10基因的小鼠感染衣原体后会发生较强的炎症反应而损害机体组织[18]，缺乏IL-10基因的细胞也不利于沙眼衣原体的存活[19]。本研究结果提示沙眼衣原体通过诱导IL-10活化STAT3蛋白从而抑制炎症因子的产生，一方面可以降低机体的炎症反应程度，另一方面也不利于衣原体的清除，这可能是衣原体在宿主细胞中长期存活的策略之一。