转Cry1Ah基因抗虫玉米对无脊椎动物多样性影响研究

2019-10-23任梦云陈彦君

农业环境科学学报 2019年10期

任梦云，陈彦君，关潇

（1.中国环境科学研究院，北京 100012；2.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021；3.海南大学热带农林学院，海口 570228）

利用生物工程手段，将某些外源基因转移到其他生物物种中去，使其表现出原物种不具有的产物和性状，这种新的生物体称为遗传修饰生物体（Genetically modified organisms，GMO）。为满足人们的生产、生活所需，大多数转基因作物具有重大的社会和经济价值，如转基因棉花的商业化推广，有效地降低了棉铃虫等靶标害虫的数量，降低了对化学杀虫剂的依赖，缓解了害虫的抗药性压力，减缓了杀虫剂对环境生态的影响[1]。

节肢动物群落作为自然生态系统重要的组成部分，是维持农田生态环境正常生态功能的重要因素[2-3]，被广泛用作农田生态系统功能研究的对象之一。此外，昆虫群落的多样性体现了一定范围内生物之间、生物与环境之间的关系，因此，昆虫群落多样性也是转基因作物环境安全评价的重要指标之一。

近年来，针对转基因作物对于田间昆虫多样性影响以及虫害调查开展了的一系列研究。有研究表明，转基因抗虫玉米对田间节肢动物群落多样性无显著影响[4-6]；而Cry杀虫蛋白基因对亚洲玉米螟表现出一定毒力[7]，已被广泛地应用于生产生物农药和植物转基因工程。近年来，由于转基因技术的发展，转Bt基因抗虫玉米因可以有效降低玉米螟的危害而被广泛应用[8]。

线虫是土壤生态系统中种类最多、数量最为丰富的主要功能种群之一，能够充分反映土壤食物网结构和功能的综合性状[9]，并参与土壤物质分解、养分循环和土壤肥力保持等相关过程[10-11]。目前已被当作农业生态系统是否受到干扰的灵敏性指示生物，具有独特的优势[12-14]。现如今有关于转基因作物种植对土壤中线虫影响的报道结果存在一定差异，有研究证明转基因作物种植对土壤中线虫的群落多样性无显著性差异[15-17]，同时也有研究表明转基因作物的种植对线虫的数量存在一定程度的影响[18]。

玉米是我国研究较多的转基因作物，目前我国获得生产应用安全证书转基因玉米是转植酸酶基因玉米，转Bt基因抗虫玉米（Cry1Ac-M、Cry1Ie、Cry1Ah等）现在已进入生物安全评价的生产性或环境释放试验阶段，在转基因作物种植带来巨大社会经济效益的同时，其潜在的环境安全问题也需引起人类的高度重视，因此我们有必要对其可能造成的生态环境影响进行评估[19-20]。本研究于2018年玉米生育期期间系统地调查了转Bt Cry1Ah基因玉米（HGK60）田间昆虫的种类，主要分析了转基因玉米对田间昆虫群落多样性、玉米主要虫害以及对土壤线虫群落多样性的影响，以期为转基因抗虫玉米的生态安全性评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于海南省乐东黎族自治县中国农业科学研究院试验基地，试验采取随机区组设计，试验组为转基因抗虫玉米HGK60（Cry1Ah），对照组为其对照常规玉米郑58，每个处理4个重复，每个小区150 m2（10 m×15 m）。不同品种间设置1 m宽空白隔离带（图1）。种植方式为一穴一粒、一穴两粒循环，行距60 cm，株距25 cm。本试验全生育期所需水肥同常规种植，记录施肥、除草剂的用量和周期。2018年3月播种。

图1 样地设置Figure 1 Sample plot

所用玉米材料为转基因抗虫玉米HGK60（Cry1Ah）及其对照常规玉米郑58，均由中国农业科学院生物技术研究所提供。

1.2 样品采集

1.2.1 田间昆虫的采集

在玉米生长的苗期（4月18）、喇叭口期（5月11）、抽穗期（6月11）、完熟期（7月6号）进行昆虫样品采集，每次采样时间为昆虫活动频繁的16：00—18：00，使用五点取样法、直接观察法、陷阱调查法进行调查。

直接观察法：用于植株上节肢动物种类数量的调查。每小区调查10株玉米。记录玉米植株上所有的节肢动物的种类及数量。

陷阱调查法：用于地表节肢动物的调查。每点埋设5个直径7.5 cm的塑料杯，间隔0.5 m，杯中放有5%的洗涤剂水（防冻液），水量为杯容积的1/3，过夜后调查杯中的节肢动物种类和数量。

线虫的采集：分别于苗期、喇叭口期、抽穗期、完熟期进行4次土壤样本的采集。使用土钻在玉米植株根际周围5 cm处钻取0～20 cm耕土层，每个小区采用五点取样法，土样带回室内剔除杂物后分离土壤线虫。

1.2.2 虫害玉米样品的采集与鉴定

于玉米成熟后收获前调查一次，采用五点取样法，每小区3株玉米。采用纵剖茎秆的方法，调查茎秆内部是否有钻蛀类害虫，记录玉米秸秆的危害状况（钻蛀空道长度、受害穗尖长度等）。

1.2.3 土壤线虫的分离与鉴定

（1）线虫的分离：采用浅盘分离法[21]，具体步骤如下：将200 mL土样倒在平铺两张纸巾的筛盘上，并将此筛盘缓慢套放于盛有1/3清水的浅盘上，须使水面淹没材料。处理过的浅盘在室温下保持24 h，24 h后收集浅盘中的线虫滤液。每个浅盘共收集一次线虫。除去过多的水和杂物，用600目筛过滤3次，收集过滤筛上的线虫，置于桌上静置待镜检。

（2）植物线虫临时玻片的制作[22]：先在洗净的载玻片上用打孔器打一个蜡圈，再在打有蜡圈的载玻片中央用移液枪滴一滴水，在体视解剖镜下用挑针挑取目标线虫于水滴中，加盖玻片后转移至控温电热板上，待蜡圈融化后便可拿下。冷却后标注信息置于玻片盒中，待镜检。

（3）线虫鉴定及数量统计：根据形态学将线虫鉴定到属，再分属在解剖镜上计数线虫数量。线虫鉴定参考《植物线虫分类学》[22]和《中国土壤动物检索图鉴》[23]。将线虫分为4个营养类群：食细菌线虫（Bacterivores）、食真菌线虫（Fungivores）、植食性线虫（Plant-parasites）和杂食/捕食性线虫（Omnivorespredators）[24]。

1.3 数据统计与分析

统计分析各个调查时期节肢动物群落的结构与组成，计算各时期各群落的多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数。

1.3.1 节肢动物生态指标

香农多样性指数：H=-∑PilnPi

群落均匀度采用均匀度指数测度：J=H/lnS

Simpson优势集中性指数：C=∑P2i

式中：Pi为第i种物种的比例多度；S为群落中物种总数目。

1.3.2 线虫生态指标

香农多样性指数：H′=-ΣPilnPi

优势度指数：λ=ΣP2i

物种的丰富度Margalef指数：D=（S-1）/lnN

式中：S为群落中的物种总数目；N为观察到的所有物种的个体总数。

均匀度指数：J=H′/Hmax（其中Hmax=lnS）

式中：H′为实际观察的物种多样性指数；Hmax为最大的物种多样性指数。

线虫通道指数（Nematode channel ratio，NCR）：

NCR=BF/（BF+FF）

式中：BF为食细菌线虫数量；FF为食真菌线虫数量。NCR为0，表明完全依靠真菌分解途径；NCR为1，则表明完全依靠细菌分解途径[25]。

瓦斯乐斯卡指数（Wasilewska index，WI）：

WI=（BF+FF）/PP

式中：PP为植食性线虫数量。

植食性线虫成熟指数（Plant-parasitic index，PPI）：

PPI=Σ（c-pi）pi（仅包括植食），评价外界影响土壤稳定性。

式中：c-pi为赋予某一种类线虫的c-p值；pi为某一种类的个体数占所调查的总个体数的比例。

自由生活线虫成熟指数（Maturity index of freeliving nematodes，MI）：

MI=Σ（c-pi）pi（仅包括自由生活线虫）

利用Excel 2003进行数据整理，利用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计分析。使用Duncan法进行多重分析。

2 结果与分析

2.1转基因玉米对田间昆虫的影响

对供试玉米材料在2018年全生育期内田间昆虫种类进行调查，结果显示，玉米植株田地的昆虫群落由7目19科、67种昆虫组成（表1）。

香农多样性指数计算结果显示，HGK60田间昆虫的群落多样性仅在苗期显著低于郑58（P＜0.05），其他生育期差异不显著（P＞0.05）。均匀度指数计算结果显示，HGK60仅在苗期显著低于郑58（P＜0.05），其他生育期差异不显著（P＞0.05）。优势集中性指数计算结果显示，HGK60与郑58在各个生育期差异均不显著（P＞0.05），但随生育期的推进，优势集中性逐渐下降（图2）。

2.2 转基因作物种植对玉米主要虫害的影响

HGK60的植株茎秆上蛀孔平均数量为0.5个·15株-1，最长隧道长度为7.1 cm，植株上活虫数量为0.75头·15株-1；而郑58茎秆上蛀孔平均数量为7个·15株-1，最长隧道长度为18.3 cm，植株上活虫数量为4.75头·15株-1。HGK60在蛀孔数量、隧道长度、活虫数量上低于郑58，表现出对钻蛀类害虫具有明显的抗性。

根据试验方案，每个小区最终检视15株植株，每个处理共60株。HGK60材料上共有6株的穗尖受到虫害，而对照常规玉米郑58则有26株的穗尖受害。这些数量上的差异表明HGK60对害虫具有明显的抗性（表2）。

2.3 转基因玉米对线虫的影响

2.3.1 线虫总数的统计

从线虫总数的动态分析，转基因玉米和非转基因玉米根分泌物对根围土壤线虫的总数影响并不明显，二者在玉米不同生长期对线虫总数的影响差异不显著（P＞0.05）（图3）。

在整个玉米生长周期中，HGK60根围共发现25个属线虫，郑58共发现26个属线虫，总数差异不大；但值得关注的是，其中对玉米根围存在潜在危险性的植食性线虫，郑58有9属，HGK60仅有7属，且HGK60的杂食捕食性线虫比郑58多2个属（表3）。不同玉米的根围分泌物是否对根围土壤线虫种群结构造成影响有待进一步研究。

表1 玉米田间昆虫群落的目、科、种分布Table 1 Patterns of insect from maize field in different orders，families and species

2.3.2线虫生态指数分析

HGK60在栽培早期（苗期）干扰了根围土壤线虫的多样性，与郑58间呈显著差异（P＜0.05）。该试验田整体上以细菌分解途径为主，仅在栽培早期HGK60处理NCR与郑58差异显著。在本研究中，HGK60 PPI持续上升，郑58呈现先上升，生长后期下降的趋势；但在栽培初期和末期两者间差异不显著（P＞0.05）（图4）。

优势度指数λ随着玉米生长逐渐减小，玉米栽培初期，HGK60显著大于郑58处理（P＜0.05），随着玉米生长逐渐减小，且两者间差异不显著（P＞0.05）。随着玉米根系生长，线虫丰富度指数D逐渐增高，但HGK60、郑58之间差异不显著（P＞0.05）（图4）。

均匀度指数J在玉米初期，HGK60显著小于郑58（P＜0.05），其他生育期差异不显著（P＞0.05）（图4）。

2.3.3 营养类群分析

在玉米栽种早期，HGK60的食细菌线虫数明显多于郑58，但随后两者数量趋于相当。在整个玉米生长期，根围食真菌线虫种群数量整体上变化不大，仅在玉米栽种早期，HGK60的食真菌线虫数明显比亲本郑58少，随后两者数量趋于相当（图5）。

图2田间昆虫群落各指数动态图Figure 2 Dynamic of biodiversity index of insect community in the fields

表2 收获前期2种玉米材料危害情况统计Table 2 Statistics on the hazardous situation of two kinds of maize materials in the early stage of harvesting

图3 线虫总数的统计Figure 3 Statistics of nematodes

在本研究中，HGK60植食性线虫数量持续上升，郑58呈先上升玉米生长后期下降的趋势。栽培初期，HGK60显著高于郑58（P＜0.05），但在抽穗期调查发现两者间差异不显著（P＞0.05）。到完熟期，HGK60的植食性线虫数量显著多于郑58（P＜0.05）（图5）。

本试验田中，杂食-捕食线虫占线虫总数比例最少，在玉米栽培后期数量略有上升，在栽培后期HGK60显著少于郑58（P＜0.05）（图5）。

3 讨论

近年来国内外在转基因作物安全性方面的研究已经取得很大进展，转基因抗虫棉花、转基因抗虫水稻以及转基因耐除草剂大豆等对节肢动物群落结构影响的研究均取得了一定的成果[26-28]。目前中国批准的商业化生产的转基因作物只有棉花和番木瓜，国内研究最多的是转Bt基因抗虫棉对害虫和天敌的影响，由于转基因玉米在我国尚未被批准商业化种植，所以有关转基因玉米对无脊椎动物的多样性影响研究相对较少。从目前已有的研究来看，绝大多数的试验结果都支持转基因玉米对节肢动物、土壤动物群落多样性的影响较小的结论[4，29-31]。本研究以转基因抗虫玉米为研究对象，对其全生育期田间节肢动物群落和线虫群落多样性进行调查分析，结果显示HGK60与郑58相比，在物种丰富度、群落多样性、优势集中性和群落均匀性等几个指数表示的群落性质上不存在显著差异。这与前人的研究结果基本一致，说明转基因作物的种植对田间节肢动物群落多样性、线虫群落多样性没有显著影响，为转基因玉米的安全性评价提供了基本的数据支持[32]。对HGK60与郑58田间昆虫的多样性指数、均匀度数和优势度指数进行分析比较，其在个别生理时期略有波动，苗期转基因玉米HGK60的多样性指数H和均匀性指数J显著低于非转基因玉米郑58，在其他3个时期，转基因玉米也倾向于低于非转基因玉米，随着生育期的推进，总体趋势趋于一致。这与其他学者的研究结果较为一致[33-35]，转基因抗虫作物与亲本相比，具有抗虫性，在作物的各个发育期，可有效防治害虫的发生，降低田间昆虫群落多样性，但总体无显著性差异。

表3 玉米田间土壤线虫科属的分布Table 3 Patterns of nematode in soil from maize field in different families and genuses

转基因抗虫玉米HGK60在蛀孔数量、隧道长度、活虫数量上显著低于对照常规玉米郑58，表现出对钻蛀类害虫具有明显的抗性。穗尖被害情况亦表明HGK60对害虫具有明显的抗性。转基因抗虫玉米体内稳定表达的Bt毒蛋白可能能够通过对非靶标昆虫产生直接（如通过植食性昆虫取食）或者间接（如通过食物链）的影响[36-37]，从而有效地控制玉米螟数量，进而降低作物的虫害程度。

转基因植物的非靶标效应是生态安全评估和环境监测的重要组成部分[38-39]。土壤线虫群落分析目前已成为指示土壤生态系统结构和功能变化的有力工具[9]。对线虫的数量动态变化研究结果显示，转基因玉米的种植对土壤线虫的总数影响并不明显，不同生长期转基因玉米与非转对照对线虫总数的影响差异不显著，转基因玉米的种植未对线虫的生态指标和群落结构造成显著影响，这与前人的研究结果相似[40-44]。但也有部分学者认为，转基因作物的种植会对生物群落的结构及功能带来一定的影响[45-46]。

图4 线虫生态指数分析Figure 4 Analysis of nematode ecological index

本研究发现，转Bt基因（Cry1Ah）抗虫玉米的田间种植降低了植食性线虫的比例，也降低了植食线虫和杂/捕食线虫的比例，这与其他学者关于转Bt油菜的田间种植研究结果类似[47]，整个生育期转基因玉米田和对照亲本玉米田土壤线虫数量差异不显著（P＞0.05）。对线虫生态指数和营养类群分析中发现，在栽培初期和抽穗期，HGK60植食性线虫数量、植食性线虫成熟指数与亲本郑58相比差异不显著（P＞0.05）。完熟期，HGK60的植食性线虫数量又显著多于郑58（P＜0.05）。本文推测转基因抗虫玉米HGK60可能会加快植食性线虫生长繁殖，提高植食性线虫的比例，但其是通过何种手段和途径得以加快植食性线虫生长繁殖，是否受土壤速效钾、速效磷、碱解氮、有机碳和有机质含量影响，还需要进一步的野外试验验证加以明确。

图5 线虫营养类群分析Figure 5 Analysis of nematode nutrition groups

综上所述，与对照常规玉米郑58相比，转基因抗虫玉米具有一定的抗虫性，且并未对田间昆虫动物群落多样性产生显著影响。该研究结果为转基因抗虫玉米的进一步研究提供一定基础数据。然而由于本实验仅为单年单点实验，试验规模较小，存在着一定的欠缺，接下来需连续多年多点进行试验，以获得更加准确、全面且可靠的研究结果，更好地为转基因玉米的生态环境安全进行评估。