基于高通量测序技术分析2种菌草根际土壤细菌群落多样性

叶文雨 廖海萍 许钰滢 谢序泽 倪明月 胡红莉 余文英 鲁国东

摘  要  為详细了解福州菌草基地巨菌草和绿洲一号2种菌草的根际土壤细菌群落组成与结构，本研究应用高通量测序技术，分析了巨菌草和绿洲一号根际土壤细菌群落结构及多样性。结果表明，菌草根际土检测到细菌类群主要的优势菌门为酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋门（Nitrospirae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）;主要的优势菌纲为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteria-6）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteriia）、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）;主要的优势属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、链球菌属（Streptococcus）、红游动菌属（Rhodoplanes）、不动细菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）。绿洲一号、巨菌草及其对照根际土壤细菌Shannon-Wiener指数分别为9.05、8.733、7.61;巨菌草、绿洲一号及其对照根际土壤细菌Simpson多样性指数分别为0.01、0.014、0.037;巨菌草、绿洲一号及其对照根际土壤细菌Chao1指数分别为3145.320、3647.482、2329.344。Alpha多样性指数分析得出，在3个土壤样品中，绿洲一号根际土Shannon指数最大，对照土壤Shannon指数最小，对照土壤Simpson指数最大，绿洲一号Simpson指数最小，说明菌草根际土壤细菌群落多样性高于非根际土土壤细菌群落多样性，绿洲一号根际土土壤细菌群落多样性略高于巨菌草根际土壤细菌群落多样性，这些结果为进一步研究土壤微生物提供了理论基础。

关键词  菌草;根际土壤;细菌群落多样性;高通量测序中图分类号  S154.3; S54      文献标识码  A

Rhizosphere Soil Bacterial Community of Juncao by High-throughput Sequencing Techniques

YE Wenyu^1，2， LIAO Haiping²， XU Yuying²， XIE Xuze²， NI Mingyue³， HU Hongli³， YU Wenying²，LU Guodong^1，3*

1. National Engineering Research Center of Juncao Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  Diversity analyses were investigated by the high-throughput sequencing to study the composition and diversity of bacterial communities in the rhizosphere soil ofPennisetum giganteumandArundo donax cv. Lvzhou No. 1. Results showed that the dominant phyla of all samples were Acidobacteria， Proteobacteria， Actinobacteria， Firmicutes， Chloroflexi， Gemmatimonadetes， Nitrospirae， Verrucomicrobia， Planctomycetes. At the class level， nine dominant species were found in all samples， such as Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Bacilli， Actinobacteria， Acidobacteria-6， Betaproteobacteria， Acidobacteriia， Ktedonobacteria， Deltaproteobacteria. At the genus level， dominant species were found in all samples， such asStaphylococcus，Saccharopolyspora，Paenibacillus，Serratia，Streptococcus， Rhodoplanes，Acinetobacter，Pseudomonas. The Shannon-Wiener from the samples was 9.05， 8.733， 7.61， respectively. The Simpson index from the samples was 0.01， 0.014， 0.037， respectively. The Chao1 index from the samples was 3145.320， 3647.482， 2329.344， respectively. The result of Alpha diversity analysis showed that the Shannon index， Simpson index and Chao1 index of Juncao increased. The diversity index analysis showed that in the soil samples， the lowest bacterial diversity was in the experimental control soil and the highest bacterial diversity was in theA. donax cv. Lvzhou No. 1 rhizosphere soil. The bacterial diversity in theA. donax cv. Lvzhou No. 1 rhizosphere soil was slightly higher than that in thePennisetum giganteumrhizosphere soil.

Keywords Juncao; rhizosphere soil; diversity of bacterial communities; high-throughput sequencing

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.016

根際（rhizosphere）是指受植物根系活动的影响，在物理、化学和生物学性质上不同于土体的那部分微域土区^[1-2]。根系和根际土壤微生物形成了互惠的关系，植物根系分泌物影响根际土壤微生物的群落，反之，根际土壤微生物影响植物根系的生长、对营养的吸收等^[3-6]。根际土壤微生物还可以增加植物的抗逆境能力及改善土壤酸碱度等^[7-8]。近年来，诸多学者对植物根际土壤微生物开展了相关研究工作^[9]。研究表明，分离自香蕉根际土的芽孢杆菌PAB-1、PAB-2不仅能有效促进其苗期植株生长，还能抑制香蕉枯萎病的发生^[10]。研究表明，荧光假单胞菌、蜡状芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌对南方红豆杉苗期的生长具有促生作用^[11]。巨菌草和绿洲一号^[12]是可以作为栽培食用菌、药用菌的培养基的草本植物，多年研究发现，菌草营养成分丰富，产量高，适应性广，抗逆性强，可以作为动物的饲料，种植菌草可以净化和改良土壤，治理水土流失，防沙治沙，改善生态环境等作用。菌草在国内广泛种植，由于福州是菌草引种的发源地，福州有许多地方均种植了菌草。基于菌草的广泛作用及根际微生物的巨大作用，因此研究菌草根际微生物是十分必要的。本文采用高通量测序技术，研究巨菌草和绿洲一号根际土壤中细菌的物种组成、群落结构及多样性，为进一步探讨土壤微生物的功能以及微生物资源的开发利用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1  研究區概况  福州市仓山区菌草基地位于福州市南部南台岛上，海拔多在600～1000 m，亚热带季风气候，年平均气温为20～25 ℃，年平均降水量为900～2100 mm。

1.1.2  试验材料  巨菌草（Pennisetum giganteum）和绿洲一号（Arundo donax cv. Lvzhou No. 1）的根际土壤和非根际土壤。由于巨菌草和绿洲一号生长在同一试验基地，因此对照采用了合并2个非根际土样的方法。具体样品编号为：FSLV（绿洲一号根际土）;FSJU（巨菌草根际土）;FSCK（对照非根际土）。土壤样品采集采用全妙华等^[13]的取样方法。本试验3次生物学重复。

1.1.3  仪器与设备  NanoDrop 2000c型超微量分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司。EDC810型PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1  土壤总DNA提取  采用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒（美国MP Biomedicals），参照提取说明进行土壤总DNA的提取^[14]，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，同时采用超微量分光光度计检测提取DNA的浓度，提取合格的DNA于?20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2  16S rRNA PCR扩增及高通量测序  以稀释后的土壤微生物基因组DNA为模板，采用16S rRNA基因V4区特异性引物515F（GTGCC AGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHV GGGTWTCTAAT）进行扩增^[15-16];PCR反应体系为Phusion Master Mix（2×）15 μL、Primer（2 μmol/L）3 μL、DNA模板10 μL（5～10 ng）、ddH₂O 2 μL。反应程序：98 ℃预变性1 min;30个循环包括（98 ℃，10 s;50 ℃，30 s;72 ℃，30 s）;72 ℃，5 min。同时每个样品做3个技术重复，将同一样品PCR产物混合后经电泳检测、割胶纯化、浓度检测等操作后，将样品送到诺禾致源生物有限公司，使用New England Biolabs公司的NEB Next^?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。

1.2.3  序列生物信息学分析  测序得到的原始数据（raw data）^[17]，进行拼接、过滤，得到有效数据（clean data）。基于有效数据进行OTUs（ope ra ti onal taxonomic units）聚类和物种分类分析，根据OTUs聚类结果，一方面对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时，对OTUs进行丰度、Alpha多样性、Venn图等分析，以得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息等。

2  结果与分析

2.1  2种菌草土壤微生物群落结构变化

2.1.1  门水平群落结构分析  由图1可知，巨菌草和绿洲一号根际土壤细菌群落在门类水平上主要类群为酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes），相对丰度分别为87.60%、97.67%、31.70%、21.39%、13.28%、10.46%、5.98%、7.59%、7.01%。巨菌草和绿洲一号根际土变形菌门（Proteobacteria）是优势菌门，其非根际土放线菌门（Actinobacteria）是优势菌门。

2.1.2  纲水平群落结构分析  由图2可知，巨菌草和绿洲一号根际土壤细菌群落在纲类水平上主要类群为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线菌纲（Actinobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteria-6）、β-变形菌纲（Betaprote obacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteriia）、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）、δ-变形菌纲（Deltapro teobacteria）相对丰度分别为34.08%、29.58%、19.70%、16.30%、16.30%、17.63%、12.00%、7.25%、15.87%。巨菌草和绿洲一号根际土γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）是优势菌纲，其非根际土DA052是优势菌纲。

2.1.3  属水平群落结构分析  由图3可知，巨菌草和绿洲一号根际土壤細菌群落在属水平上主要类群为葡萄球菌属（Staphylococcus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、类芽孢杆菌属（Paeni bacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、链球菌属（Strep tococcus）、红游动菌属（Rhodoplanes）、不动细菌属（Acinetobacter）、未确定属（Candidatus Solib acter）、未确定属（Candidatus Koribacter）、假单胞菌属（Pseudomonas），相对丰度分别为8.92%、5.49%、1.71%、2.93%、5.52%、4.89%、2.01%、3.61%、3.31%、0.98%。巨菌草和绿洲一号根际土葡萄球菌属（Staphylococcus）是优势菌属，其非根际土未确定属（Candidatus Koribacter）是优势菌属。

2.2  2种菌草土壤细菌群落丰度和多样性估计

Alpha多样性指数可以反映各群落内微生物多样性的丰富度。表1是不同处理土壤样本的Alpha多样性指数统计表，ACE指数和Chao1指数是2种用于估计群落中含OTU数目的微生物多样性指数的方法，在生态学中常用来估计物种的总数。由表1可以看出，巨菌草和绿洲一号根际土壤样本的ACE指数和Chao1指数均高于对照，表明巨菌草和绿洲一号根际土壤样本中土壤的细菌丰度高于非根际土。巨菌草根际土壤样本的ACE指数和Chao1指数均高于绿洲一号，表明巨菌草根际土壤样本中细菌总数高于绿洲一号根际土细菌总数。菌草根际土与非根际土的覆盖率都在90%以上，能较好的反映样本的真实情况。绿洲一号土壤样本的Shannon-Wiener指数最大，说明细菌群落多样性程度越高，Simpson指数最低的为绿洲一号，Simpson指数值越小，说明细菌群落多样性越大。综合以上分析结果说明，菌草根际土壤细菌的多样性和丰度都比非根际土壤细菌的高。巨菌草和绿洲一号根际土壤细菌的多样性和丰度也略有不同，绿洲一号的细菌群落多样性略高于巨菌草。

2.3细菌群落的相关性分析

图4为巨菌草和绿洲一号根际土壤细菌的OTU Venn图由图4可知，巨菌草和绿洲一号及其对照的土壤样本中分别检测到3701、3610、2947个OTU，其中共有的OTU为2310个，特有的OTU依次为427、322、157个，分别占巨菌草、绿洲一号及其对照土壤样本中总OTU的11.54%、8.92%、5.33%。

2.4基于OTUs的主坐标分析

为了更清晰地了解不同菌草间土壤微生物群落组成结构的特征，通过分析不同样本OTU组成，对样地的土壤细菌群落数据实施了主坐标分析（PCoA），不同菌草根际土间的样本表现出分散或聚集的分布情况，结果如图5所示，以两坐标轴的零基准线为参考进行PCoA分析。图5中绿洲一号与PC2轴相距均较近，说明绿洲一号中细菌菌群结构受主成分PC2的影响大，PC2一种主成分对样品中菌群结构的影响达到总影响因子的11.97%，图5中巨菌草与PC1轴相距均较近，说明巨菌草中细菌菌群结构受主成分PC1的影响大，PC1一种主成分对样品中菌群结构的影响达到总影响因子的80.91%;而对照与PC1、PC2轴相距较远，说明对照样品中细菌菌群结构受主成分PC1和PC2的影响不大。因此，通过主坐标分析可见，细菌群落PC1和PC2分别解释80.91%和11.97%差异性，绿洲一号、巨菌草及对照没有聚在一起，说明微生物差异大。

2.5优势细菌的系统发育分析

选取相对丰度排名前10的属所对应的OTUs数据进行多序列比对，并绘制了系统发育进化图（图6）。图6展示了菌草根际与非根际土壤样品中相对丰度排名前10的属细菌所对应的OTUs系统发生关系数据，表明菌草根际与非根际土壤样品中主要分布于以下10个属：葡萄球菌属（Sta phy lococcus）、链球菌属（Streptococcus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、红游动菌属（Rhod o pl anes）、暂定菌属（Candidatus Solibacter）、暂定菌属（Candidatus Koribacter）、沙雷氏菌属（Serr at ia）、硫酸盐还原菌属（Desulfovibrio）、不动细菌属（Acinetobacter）、类芽孢杆菌属（Paen iba cillus），其中有2个暂定菌属。

3  讨论

近年来，高通量测序技术已广泛用于植物根际微生物群落的研究。本研究采用高通量测序技术对巨菌草和绿洲一号根际土壤及其非根际土细菌群落多样性进行了研究，得出了巨菌草和绿洲一号根际土壤及其非根际土细菌群落所属的门、纲、目、科、属、种不同分类水平上的优势类群及其相对丰度。本研究结果表明，在门的水平上，巨菌草和绿洲一号根际土壤及其非根际土细菌群落前3优势菌门为酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actin oba cteria）;放线菌是植物根际土中一类重要的微生物，在促进植物生长方面，防治病害方面起到重要作用^[18-19]。在纲水平上，其前3优势菌纲为g-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、a-变形菌纲（Alpha proteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）;研究表明，玉米根际细菌中g-变形菌纲（Gamm a proteobacteria）、a-变形菌纲（Alphaprot eobacteria）和酸杆菌（Acidobacteria）所占比例较高^[20-21]。在属水平上，其前3优势菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Strep tococcus）、糖多孢菌属（Sacchar opo lyspora）。研究结果说明，巨菌草和绿洲一号根际土及非根际土菌落多样性不同，可能是由于不同植物根系對根际土细菌群落影响不同，根系分泌物的数量与质量是影响根际细菌群落的重要因素。

研究表明，沙雷氏菌属、假单孢菌属、芽孢杆菌属可以产生生长素、赤霉素等促进植物生长，可以固氮、溶磷等促进植物对养分的吸收，进而改善根系构型、减少肥料的施用^[22-26];假单孢菌属可以提高植物的耐盐性^[27-28];总之，根际微生物可以调节和改善土壤的微生态环境。多样性分析结果表明，巨菌草和绿洲一号根际土细菌群落的多样性与丰富度均略高于非根际土细菌群落的多样性与丰富度。绿洲一号根际土细菌群落多样性略高于巨菌草根际土细菌群落，在同样的生长环境条件下，这可能与植物根系分泌物不同有关。本研究结果为进一步深入研究菌草根际土微生物功能提供了理论数据。

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