新鲜山柰、海南三七油细胞原位拉曼光谱研究

司民真 李伦 张川云 张德清 李家旺 杨永安

摘  要  將新鲜山柰、海南三七块根的切片置于DXR 激光共焦显微拉曼光谱仪下，用10倍物镜观察到山柰、海南三七的油细胞。将激光聚焦在油细胞上，获得了山柰、海南三七油细胞中的精油拉曼光谱，不同油细胞上获得的拉曼光谱非常相似。山柰的拉曼光谱与甲氧基肉桂酸乙酯的拉曼光谱，海南三七的拉曼光谱与苯甲酸苄脂的拉曼光谱在峰形、峰位上都非常相似。采用密度泛函理论（DFT）计算了甲氧基肉桂酸乙酯及苯甲酸苄脂拉曼光谱，计算的拉曼光谱与实验的拉曼光谱非常相似，据此对甲氧基肉桂酸乙酯拉曼光谱和山柰油细胞中的精油拉曼光谱及苯甲酸苄脂拉曼光谱和海南三七油细胞中的精油拉曼光谱进行了初步的归属，说明山柰的主要挥发物为甲氧基肉桂酸乙酯，海南三七的主要挥发物为苯甲酸苄脂。

关键词  拉曼光谱;山柰油细胞;海南三七油细胞;甲氧基肉桂酸乙酯;苯甲酸苄脂中图分类号  O657.37      文献标识码  A

In Situ Research on Fresh Kaempferia galanga L. and Kaempferia rotunda L. Oil Cells with Raman Spectroscopy

SI Minzhen^1，2， LI Lun^1，2， ZHANG Chuanyun^1，2， ZHANG Deqing^1，2， LI Jiawang^1，2， YANG Yongan^1，2

1. Key Laboratory of Molecular Spectroscopy， Colleges and Universities in Yunnan Province， Chuxiong Normal University， Chuxiong， Yunnan 675000， China; 2. Application Institute of Spectroscopy Technology， Chuxiong Normal University， Chuxiong， Yunnan 675000， China

Abstract  To identify the ingredient in the oil cells ofKaempferia galanga L. andKaempferia rotunda L. at room temperature， and to avoid sample pretreatment and extractions which can be labor intensive， the work showed the possibility to detectin situthe main components of the essential oils in the two plants oil cells by Raman spectroscopy. Under the DXR laser confocal micro Raman spectrometer， the oil cells could be seen with objective lens of 10×. Different oil cells had similar Raman spectrum. The Raman spectrum of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate was obtained. The Raman spectrum of K. galanga L. was correlated very well with that of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester， and that ofK. rotunda L. was correlated very well with that of benzyl benzoate. The Raman spectroscopy of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate was calculated by the density functional theory （DFT）. The Raman spectroscopic bands were assignment with the help of calculation. It indicated that the essential principal oil components ofK. galanga L. andK. rotunda L. in the oil cells were 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate.

Keywords  Raman spectrum;Kaempferia galangaL.;Kaempferia rotundaL.; 4-methoxycinnamic acid ethyl ester; benzyl benzoate

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.021

姜科（Zingiberaceae）山柰属（Kaempferia L.）植物全世界有70种，我国有4种，即白花山柰（Kaempferia candida Wall.）、紫花山柰（Kaem pferia elegans （Wall.） Bak.）、山柰（Kaempferia galanga L.）和海南三七（Kaempferia rotunda L.），其中山柰和海南三七在我国均有栽培，山柰根茎可作调香原料，海南三七花美丽、芳香^[1]。这2种植物均为姜科根香类香料植物，用水蒸气蒸馏法从云南屏边产山柰提取挥发油，通过气-质联用技术对挥发油的主要化学成分进行分析，其主要的挥发物为t-桂酸乙酯（31.95%）、t-对甲氧基桂酸乙酯（25.16%）、1-8桉叶油（8.27%），而西双版纳产海南三七的主要挥发物为苯甲酸苄酯（67.12%）、乙酸龙脑酯（10.95%）、樟脑（6.65%）^[2]。此外，陈福北等^[3]对广西南宁产山柰鲜品用索氏法提取挥发油，通过气-质联用对挥发油的主要化学成分进行分析，主要挥发物为反式对甲氧基肉桂酸乙酯（72.56%）、反式肉桂酸乙酯（12.56%）、十五烷（6.38%）。佘金明等^[4]用水蒸气蒸馏法从广东产山柰中提取挥发油成分，通过气-质联用技术（GC-MS）对其分离检测，其中主要化学成分为正十五烷（31.02%）、反式桂皮酸乙酯（23.49%）和对甲氧基肉桂酸乙酯（14.86%）。黎强等^[5]用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分别对广西、广东及云南山柰中挥发性化学成分研究表明其主要挥发物为甲氧基肉桂酸乙酯（45.02%，41.8%，30.78%）、肉桂酸乙酯（17.18%，16.25%，15.66%）及十五烷（9.08%，8.04%，7.89%）。对海南三七挥发油的成分研究已有一些报道，Woerdenbag等^[6]采用水蒸气蒸馏气相色谱法对印尼产海南三七的块茎挥发性成分进行过研究，结果表明，其块茎中主要挥发性成分为苯甲酸苄酯（benzyl benzoate，69.7%），正十五烷（n-pentadecane，22.9%）、茨烯（camphene，1.0%）。徐世涛等^[7]采用同时蒸馏萃取GC-MS联用技术对云南西双版纳产的海南三七全株的挥发性成分进行分析研究，主要的成分为α-蒎烯（6.83%）、茨烯（13.00%）、β-蒎烯（18.97%）、茨酮（5.80%）。可见2种植物都存在提取方法不同得到的主要挥发物不同的现象。由于测量挥发性物质时使用气相色谱质谱联用技术，气相色谱进样口温度都在200 ℃以上，这可能会引起待测物中热不稳定组分的变化。因此就需要1种不需要提取，即可在室温下，快速获取山柰及海南三七挥发油的主要成分的方法。

拉曼光谱早在1923年就被德国物理学家 Smekal所预言，且在1928年3月被印度物理学家Raman 在研究液体苯散射光谱的实验中被观察到。由于这项工作Raman于1930年获得了物理学诺贝尔奖。任何2种不同的化合物均给出不同的拉曼谱图，即各谱带的波数和强度不同，由此可以对化合物进行定性分析鉴定。不同化合物中同一基团或化学键又能给出波数相近的拉曼谱带，借此又可进行官能团的鉴别。拉曼光谱技术具有非破坏性，几乎不需要样品制备，可直接测定气体、液体和固体样品，并且不受水分子的干扰等优点，因此被直接用于检测新鲜植物中的油细胞。1999年，Kiefer首次报道采用显微拉曼光谱/表面增强拉曼光谱技术对唇形科（Lami aceae）植物Thymus vulgaris和Origanum vulgaris油细胞内的精油进行原位成分分析^[8]，但其后却鲜见这方面的报道。本文采用该方法对山柰及海南三七的油细胞内的精油进行研究，得出油细胞内精油的主要成分。

1  材料与方法

1.1  材料

山柰块根，2018年5月购于广西茂名;海南三七块根，2018年8月采集于西双版纳，并经过专家鉴定。

甲氧基肉桂酸乙酯（4-Methoxycinnamic acid ethyl ester，Cas：1929-30-2）、苯甲酸芐酯（benzyl benzoate，Cas：120-54-1），购于Sigma公司。

DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪，美国热电公司，激发波长785 nm，物镜、目镜各为10×，激光功率15 MW。

1.2方法

2个植物样品徒手切片后，制成水装片待用。用Gaussian03 软件中的RB3LYP（6-311G）及B3LYP/6-311+g（d， p）方法对甲氧基肉桂酸乙酯、苯甲酸苄酯的拉曼光谱进行了计算，并在Gaussian View中确认振动模式。

2  结果与分析

2.1山柰

2.1.1  山柰不同油细胞的拉曼光谱  将激光聚焦在图1所示油细胞上，得到图2所示的拉曼光谱图。图2是不同油细胞上得到的拉曼光谱图，拉曼光谱的峰形、峰位都非常相似，说明不同油细胞中得到的拉曼光谱具有较好的重复性及稳定性，且不同油细胞中精油的主要挥发物的成分是一样的。

是甲氧基肉桂酸乙酯和山柰油细胞的拉曼光谱图。对比2者，其共有峰出现在1699/1707、1632/1634、1600/1604、1572/1576、1423/1422、1313/1313、1301/1302、1249/1249、1207/1204、1171/1171、1116/1112、883/881、865/865、846/849、779/778、636/637、550/553、380/376 cm^-1，共18条谱线（表1）。

2.1.3  甲氧基肉桂酸乙酯拉曼谱的计算及峰的归属  为了对甲氧基肉桂酸乙酯拉曼峰进行初步的归属，用Gaussian03 软件中的RB3LYP（6-311G）方法，对甲氧基肉桂酸乙酯的几何结构进行优化，在优化的基础上计算了拉曼频率。甲氧基肉桂酸乙酯的分子式及优化的分子结构见图4。

图5中a是甲氧基肉桂酸乙酯的实验拉曼谱，b是用Gaussian03 软件中的RB3LYP（6-311G）方法计算的拉曼谱，在1510～1800 cm^-1范围内乘以修正因子0.9752，在1000～1500 cm^-1范围内乘以修正因子0.9864，从图中可见2者峰型、峰位和峰的相对强度都非常相似。根据峰位和峰的相对强度由计算的拉曼光谱对实验的拉曼光谱进行初步的归属，具体结果见表1。

以甲氧基肉桂酸乙酯、山柰油细胞为序对谱峰位置相近的峰进行归属1699/1707 cm^-1（C=O伸缩振动）、1632/1634 cm^-1（C=C伸缩振动）、1600/1604 cm^-1（环的伸缩振动）、1572/1576 cm^-1（环的伸缩振动）、1423/1422 cm^-1（环的C-H摇摆振动）、1313/1313 cm^-1（C-H摇摆振动）、1301/1302 cm^-1（C-H摇摆振动）、1249/1249 cm^-1（11C-13O伸缩振动）、1207/1204 cm^-1（C-H摇摆振动）、1171/1171 cm^-1（C-H摇摆振动）、1116/1112 cm^-1（CH₃摇摆振动）、866/865 cm^-1（CH₃、C-O摇摆振动及环呼吸振动）、846/849 cm^-1（C-H摇摆振动）、779/778 cm^-1（环呼吸振动及6C-28C=26C弯曲振动）、636/637 cm^-1（環变形振动）、550/553cm^-1（环呼吸振动及3C-14O-15C弯曲振动）、380/376 cm^-1（13O-19C-22C弯曲振动）。从表1及以上的分析可见山柰的谱峰与甲氧基肉桂酸乙酯的谱峰有较好的对应关系，在1800～300 cm^-1范围内甲氧基肉桂酸乙酯明显的谱峰有18条，而山柰有18条谱峰与之对应，对应率为100%，且2者的峰位相比无明显的移动，说明山柰油细胞中精油的主要成分为甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2海南三七

图6是海南三七的油细胞。将激光聚焦在该油细胞上，获得油细胞的拉曼光谱，如图7中a所示;图7中b为苯甲酸苄脂的拉曼光谱。对比图7的a和b，可见2者的峰强、峰位都非常的相似。图7中c是用Gaussian03 软件中的B3LYP/ 6-311+g（d， p）方法计算的苯甲酸苄脂的拉曼光谱，由计算拉曼光谱对实验光谱及海南三七油细胞的拉曼光谱进行初步归属，具体结果见表2。

图8给出了苯甲酸苄脂的分子式及优化的分子结构。以苯甲酸苄脂、海南三七为序对谱峰位置相近的的峰进行归属，1719/1721 cm^-1（C=O伸缩振动）、1602/1601、1452/1452 cm^-1（环的伸缩振动），1377/1376 cm^-1（C-H₂摇摆振动），1271/1272 cm^-1（环的变形振动及C-O、C-H摇摆振动），1213/1211 cm^-1（环呼吸振动及C-C伸缩振动），1178/1172、1160/1158、1030/1028、887/885 cm^-1（C-H摇摆振动），1004/1002 cm^-1（环呼吸振动），810/804 cm^-1（环呼吸振动及 C-H摇摆振动），675/674、619/617 cm^-1（环变形振动及C-H摇摆振动），199/197 cm^-1（蝶型振动）。由于海南三七的油细胞的拉曼光谱与苯甲酸苄脂的拉曼光谱无论峰形、峰位都一致，由此可判断，海南三七的油细胞中的主要挥发物为苯甲酸苄脂。

3  討论

植物油细胞为一种异细胞，属于分泌组织之一，是产生和储存精油的主要场所^[9]，本文对山柰及海南三七油细胞内精油的拉曼光谱研究表明，其主要的挥发物为甲氧基肉桂酸乙酯和苯甲酸苄脂。山柰主要挥发物为甲氧基肉桂酸乙酯，这与文献[3]和文献[5]的结论一致，对印度产的山柰^[10-11]和马来西亚产的山柰^[12-13]研究发现，其主要挥发物也是甲氧基肉桂酸乙酯。山柰提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯具有一定的防晒功效，可用于天然防晒化妆品的开发^[14]，对有翅桃蚜具有较强的驱避作用，可以减轻蚜虫的危害，而且能够抑制病毒病的发生^[15]，山柰挥发油可以影响胃癌细胞的增殖、凋亡和周期，同时也能够影响细胞内蛋白和相关基因的表达^[16]。海南三七油细胞主要挥发物为苯甲酸苄脂这与文献[2]和文献[6]的研究结果一致，但Kumar^[17]采用水蒸气蒸馏气相色谱法得到印度产海南三七的块茎挥发性成分主要为冰片（endo-borneol，9.30%）、dehydroisoandro sterone acetate（9.12%）和β-水芹烯（β-phellandr ene，7.08%;Hasnah^[18]用同样方法得出印尼产海南三七主要挥发物是正十五烷（pentadecane，25.4%）、乙酸龙脑酯（bornyl acetate，24.9%）、苯甲酸苄酯（benzyl benzoate，15.3%）和樟脑（camphor，12.1%），与本文的结果不一致。本研究所采用油细胞原位拉曼光谱法，不需要提取，在常温、常压下就可获得油细胞中精油的拉曼光谱，可避免对山柰、海南三七油挥发物质中热不稳定组分的破坏。同时，原位拉曼测量所需样品少，测量时间短，本研究可为培育高含量对甲氧基肉桂酸乙酯的山柰及高含量苯甲酸苄酯的海南三七提供技术支持。

参考文献

• 吴德邻， 陈升振， 蔡希陶， 等. 中国植物志： 第16卷， 第2分册[M]. 北京： 科学出版社， 1981： 40-44.
• 程必强， 喻学俭， 丁靖垲， 等. 云南香料植物资源及其利用[M]. 昆明： 云南科技出版社， 2001： 330-331.
• 陈福北， 罗少华， 陈少东， 等. 山柰（鲜品）挥发油的气相-质谱联用分析[J]. 食品科技， 2009， 34（12）： 305-307.
• 佘金明， 彭友林， 梁逸曾， 等. 化学计量学解析法与山柰挥发油化学成分的GC-MS 分析[J]. 湖南文理学院学报（自然科学版）， 2010， 22（1）： 24-27.
• 黎  强， 余  凡. HS-SPME-GC-MS 联用分析不同产地山柰挥发性成分[J]. 中国药师， 2018， 21（5）： 840-842， 846.
• Woerdenbag H J， Windono T， Bos R， et al. Composition of the essential oils of Kaempferia rotunda L. and Kaempferia angustifolia Roscoe rhizomes from Indonesia[J]. Flavour and Fragrance Journal， 2004， 19（2）： 145-148.
• 徐世涛， 阴耕云， 刘劲云， 等. 海南三七的挥发性成分研究[J]. 云南大学学报（自然科学版）， 2012， 34（6）： 701-704.
• R?sch P， Popp J， Kiefer W. Raman and surface enhanced Raman spectroscopic investigation on Lamiaceae plants[J]. Journal of Molecular Structure， 1999， 480-481： 121-124.
• 黎贵卿， 陆顺忠， 江  燕， 等. 不同生长阶段肉桂叶中油细胞的形态及精油成分[J]. 广西林业科学， 2016， 45（1）： 85-88.

[10] Suprava S， Reena P， Sikha S，et al. Evaluation of yield， quality and antioxidant activity of essential oil of in vitro propagated Kaempferia galanga Linn.[J]. Journal of Acute Disease， 2014， 3（2）： 124-130.

[11] Rao V K， Rajasekharan P E， Roy T K，et al. Comparison of essential oil components in rhizomes and in-vitro regenerated whole plants ofKaempferia galangaL.[J]. Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences， 2009， 31（4）： 326-329.

• Sukari M A， Mohd Sharif N W， Yap A L C， et al. Chemical constituents variations of essential oils from rhizomes of four Zingberaceae species[J]. The Malaysian Journal of Analy tical Sciences， 2008， 12（3）： 638-644.
• Wong K C， Ong K S， Lim C L. Composition of the essential oil of rhizomes of Kaempferia galanga L.[J]. Flavour and Fragrance Journal， 1992， 7（5）： 263-266.

[14] 李  青， 韓红梅， 孙永江， 等. 山柰提取物中对甲氧基肉桂酸乙酯的体外透皮吸收研究[J]. 香料香精化妆品， 2013（5）： 43-45.

[15] 李为争， 庄  丽， 付国需， 等. 芳香植物广陈皮和山柰中有翅桃蚜驱避物质的化学鉴定[J].天然产物研究与开发， 2012， 24（12）： 1821-1827， 1796.

[16] 涂  云. 山柰挥发油胃内滞留型给药系统对胃肿瘤治疗的作用机理研究[J].实用癌症杂志， 2018， 33（10）： 1571-1574， 1578.

• Kumar A. Chemical characterization of essential oil from the rhizomes of Kaempferia rotunda L. by GC/MS technique[J]. International Journal of Pharma and Bio Sciences， 2014， 5（4）： 458-462.
• Hasnah M S， Shajarahtunnur J， Lee W S. The rhizome oil of Kaempferia rotunda Val[J]. Journal of Essential Oil Research， 2005， 17（3）： 306-307.