诺帝-褐藻酸钠微球血管内介入治疗兔VX2肝癌

杨巧丽，游 箭，蒲洪波，廖运国，胡 鸿，魏 欣，何学红

(1.重庆市妇幼保健院放射科，重庆 401120；2.川北医学院第二临床医学院南充市中心医院介入放射科，四川 南充 637000；3.贵黔国际总医院介入科，贵州 贵阳 550018)

肝癌在全球癌症相关死因中居第2位[1]。TACE是中晚期肝癌的首选治疗方法[2]，但栓塞后肿瘤内部缺血缺氧可逐渐诱导新生血管形成，促进肿瘤复发、转移[3]。诺帝是人工合成的类去甲二氢愈创木酸化合物，具有相似的结构和生物效应，对多种肿瘤及新生微血管具有抑制作用[4-5]。海藻酸钠微球(kelp miero gelation, KMG)是新型栓塞剂，具有无毒、生物相容性较好及生物降解性等物理特性，已广泛用于介入治疗肿瘤。将抗肿瘤药物包载于微球内制成载药缓释微球，是当前研究热点[6]，可于目标部位缓慢释放药物，保持稳定的血药浓度，提高肿瘤局部药物生物利用度，减少给药次数，降低全身毒副作用[7]。本研究探讨诺帝-KMG血管内介入治疗兔VX2肝癌的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 健康新西兰大白兔50只，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，重庆渝达实验兔场提供(重庆市实验动物质量合格证0002926)。VX2荷瘤兔由重庆医科大学实验动物中心提供。诺帝来自陆军军医大学西南医院病理研究所，KMG来自北京圣医耀公司。将海藻酸钠加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中稀释，将诺帝加入4% CaCl2溶液中快速搅拌至溶解(终浓度为5 mmol/L)，再将浓度为3.5%海藻酸钠溶液逐渐滴加至配制好的CaCl2溶液中，剧烈搅拌，静置4 h，离心，吸干微球表面水分，分离微球，低温干燥，得到诺帝-KMG。

1.2 实验兔模型建立 取出VX2荷瘤兔大腿内侧肿瘤组织，选取肿瘤边缘活性较强的灰白色鱼肉样质韧组织，剪成大小约1 mm3的组织。麻醉实验兔后仰卧位保定，沿剑突偏左侧1 cm逐层开腹，暴露肝左叶，用镊子轻拉出肝左叶，眼科剪刺破肝左叶较厚部位形成窦道，植入2～3块瘤块，再用明胶海绵填塞。将肝左叶回纳入腹腔后逐层缝合切口。术后肌肉注射抗生素3天预防感染。

1.3 仪器与方法 建模后2周行介入治疗。采用GE DSA(LCV+)机，腹部造影模式，管电压1 250 kV，管电流800 mA。将实验兔随机分为A、B、C、D、E组，每组10只，麻醉后经股动脉穿刺，经由微导丝引入微导管，行腹主动脉(1 ml/s，3 s)、肝固有动脉(0.5 ml/s，3 s)造影，之后超选至靶血管灌注药物，A、B、C、D、E组灌注药物分别为生理盐水、诺帝、KMG、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)+KMG、诺帝-KMG 1 ml/kg体质量，之后造影评估栓塞程度。

于治疗前1天及之后2周行增强CT扫描。采用GE Lightspeed 16排螺旋CT机，管电压100 kV，管电流100 mA，层厚1.25 mm，FOV 160 mm×160 mm，经耳缘静脉以0.5 ml/s速率注入非离子对比剂碘海醇5 ml，注射对比剂后13 s及70 s行肝脏双期扫描，测量病灶最大径(a)及最小径(b)。

1.4 肿瘤体积增长率检测 术后2周行CT增强扫描后处死实验兔，取出肝脏及肿瘤，计算肿瘤体积V(V=1/2×a×b2)及体积增长率。体积增长率=(术后V-术前V)/术前V×100%。

1.5 病理学检测 以4%甲醛溶液固定载瘤兔肝，石蜡包埋后切片，HE染色后观察肿瘤组织镜下表现，以免疫组织化学染色观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)及CD31表达。采用Weidner计数法计算微血管密度(microvessel density， MVD)，在低倍镜(×100)下选取血管“热点”区，即胞质内含棕黄色颗粒的血管内皮细胞(CD31阳性细胞)最密集的区域，于高倍镜(×400)下在染色良好、背景清晰的视野内计数，将孤立的血管内皮细胞或细胞簇或管腔<50 μm的微血管视为1个肿瘤微血管，计数5个视野并取其平均值作为最终结果。VEGF阳性细胞占总细胞百分比<5%为阴性(-)，≥5%为阳性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

50只兔均建模成功。D、E组各1只兔死于介入治疗并发症，A组1只因血管变异致手术失败，最终纳入47只兔。

术前CT平扫示实验兔肝脏类圆形低密度影、边界清楚，增强扫描呈明显环形强化、中心密度较低(图1)。术后2周兔肝癌体积不同程度增加，中心坏死更明显，部分可见肝、肺内小结节状转移灶及淋巴结转移。

图1 建模成功实验兔增强CT图像 图2 介入治疗前实验兔DSA图像 A.动脉期； B.实质期

术前DSA示动脉期肿瘤动脉增多、增粗、纡曲，局部血管网聚集成团呈“抱球征”(图2A)，实质期肿瘤由边缘环形显影逐渐呈结节状显影(图2B)；术后肿瘤显影消失，邻近部分细小肝动脉未显影。

2.1 肿瘤体积及体积增长率 术前1天各组兔肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)；术后2周，各组实验兔肿瘤体积及体积增长率总体差异有统计学意义(P均<0.01)，A、B组肿瘤体积及体积增长率均大于C、D、E组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组兔术前1天及术后2周肿瘤体积及体积增长率比较(±s)

表1 各组兔术前1天及术后2周肿瘤体积及体积增长率比较(±s)

组别体积(cm3)术前1天术后2周体积增长率(%)A组(n=9)1.42±0.237.71±0.54460.94±112.14B组(n=10)1.50±0.187.55±0.82435.27±105.71C组(n=10)1.44±0.173.94±0.34∗#176.76±36.94∗#D组(n=9)1.51±0.183.44±0.48∗#131.82±47.90∗#E组(n=9)1.55±0.213.28±0.33∗#118.10±31.64∗#F值0.83173.54427.61P值0.51<0.01<0.01

注：*：与A组比较，P<0.05；#：与B组比较，P<0.05

2.2 VEGF表达及MVD VEGF阳性细胞主要分布于瘤周及栓塞后残存瘤组织内，胞浆呈棕黄色、黄色或棕褐色，条索状、弥漫状或灶状(图3)。5组间VEGF阳性率差异有统计学意义(P<0.01)，E组低于其他各组(P均<0.05)，C组高于其他各组(P均<0.05)，见表2。

镜下可见孤立性棕黄色、棕褐色的血管内皮细胞及由多个血管内皮细胞聚集成的圆形、类圆形细胞簇或条索状微小血管，其间相互交错、连通(图4)。5组间MVD总体差异有统计学意义(P<0.01)，E组MVD低于与其他各组(P均<0.05)。

表2 各组兔肿瘤组织VEGF阳性率及MVD比较

3 讨论

3.1 VEGF表达及MVD与肿瘤复发、转移的关系 肿瘤生长过快超过肿瘤血管供给能力或肿瘤血管被阻断时，肿瘤细胞缺血、缺氧，分泌以VEGF为主的大量促血管生长因子。VEGF作用多样，与血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)-2结合后启动下游信号通路，逐步介导肿瘤血管生成[8]、提高肿瘤血管通透性[9]而致MVD升高，使肿瘤细胞血供丰富而进一步增殖，脱落的肿瘤细胞随血液循环转移至全身其他部位。VEGF可多途径、多步骤促进微血管形成，导致肿瘤复发、转移。研究[10-11]表明，在结肠癌的发生发展过程中，VEGF可通过自分泌方式与肿瘤细胞表面受体结合，直接刺激肿瘤细胞增殖。Lesslie等[12]发现，结肠癌中的VEGF可与VEGFR-1受体结合，激活Src信号通路，促进肿瘤细胞转移。肝癌为富血供肿瘤，肿瘤组织中VEGF高表达，肿瘤内部微血管丰富。合理选用抗血管生成药物，可以降低肿瘤促血管生长因子表达，与抑血管生长因子达到平衡，促进肿瘤血管构筑表型向正常化转归，降低MVD，提高疗效[13]。

图3各组兔肝癌组织VEGF免疫组织化学图(×400) A～E.分别为A～E组图4各组兔肝癌组织CD31免疫组织化学图(×400) A～E.分别为A～E组

3.2 诺帝-KMG 诺帝可抑制肿瘤血管生成及生长，给药方式包括静脉滴注及动脉内灌注。静脉滴注创伤小，但全身血药浓度及毒副作用大；动脉内灌注为有创性治疗，但局部血药浓度高、全身毒副作用小，可在抑制肿瘤血管生成的同时阻断肿瘤血供，使肿瘤细胞缺乏营养物质供应而“饿死”。何学红等[14]以携带诺帝的聚乙烯醇(PVA)颗粒栓塞兔VX2肝癌，术后实验兔不良反应较轻，肿瘤体积较对照组(注射生理盐水)及TACE组(注射碘化油乳剂+顺铂)明显减小，血清VEGF显著降低，提示其用于栓塞治疗肝癌安全有效，不仅能明显抑制肿瘤生长，还能减少肿瘤血管生成。但PVA颗粒作为一种永久栓塞剂，具有膨胀速度快、易堵管、在体内不可降解等缺点，其对子宫肌瘤的效果不及KMG[15]。

本研究成功将诺帝包载于栓塞剂KMG中，制成诺帝-KMG聚合物，用于血管内介入栓塞治疗兔VX2肝癌，较好地控制了肿瘤体积，仅1只兔出现严重并发症而死亡，提示其相对安全、有效。

3.3 诺帝-KMG对VEGF、MVD的影响 TACE是治疗中晚期肝癌的首选方法，通过栓塞肿瘤供血动脉而诱导肿瘤细胞发生缺血缺氧性坏死，并于局部灌注化学治疗药物而直接杀死肿瘤细胞[2]；但VEGF与肝癌TACE术后复发存在相关性[16]，TACE术后常因VEGF高表达而诱导新生血管形成，促进肿瘤复发、转移，使远期疗效欠佳[3]。本研究C、D组VEGF、MVD最高，镜下呈密集阳性表达，原因可能为栓塞后肿瘤内部因缺血缺氧而刺激VEGF分泌，形成大量新生微血管，与相关报道[17]相符；B组VEGF、MVD虽低于A组，但差异无统计学意义，提示单次经导管灌注诺帝可能在一定程度上抑制VEGF生成，但作用时间短、效果有限；E组VEGF、MVD最低，表明诺帝-KMG物理特性良好，于病变部位持续缓慢释放诺帝，肿瘤内部持续接受诺帝作用，生物利用度高，可明显抑制肿瘤内部VEGF生成，MVD也因此降低。本研究C、D、E组肿瘤体积增长率均低于A、B组，证实介入治疗对控制肝癌体积增长具有显著疗效；D、E组术后肿瘤体积增长率低于C组，提示诺帝具有一定抗肿瘤细胞生长作用，且与5-Fu无显著差别。

综上所述，诺帝-KMG是安全有效的载药栓塞剂，可抑制兔VX2肝癌TACE术后VEGF表达及新生血管形成，且在一定程度上抑制肿瘤细胞生长。