兽药残留中四环素的检测方法的比较实验

田翠，钟英，陈光亮，赵耀，郑海芳，刘霜，罗小娇，张维娜，张强

（泸州市农业农村局，四川泸州646000）

四环素作为一种广谱的抗生素，对于疾病的治疗和预防都有良好的效果，常被用于饲养业、畜牧业以及水产养殖业。长期以来由于价格低廉、抗菌谱广、使用方便等原因，在兽医临床上应用广泛。然而一些不法商家和养殖户为了获得更大的利益滥用抗生素，不但不能被动物吸收而以代谢产物排出体外对环境造成污染[1]，而且造成畜产品中抗生素严重超标，从而进入人体对身体造成伤害[2-5]。大量使用抗生素容易引起胃肠和肝脏的损害、致畸胎作用、二重感染，更严重的能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病。因此探究高效、快捷、准确的检测动物源性食品中四环素类抗生素的残留对人类健康有着十分重要的意义。本文通过对比动物源食品中四环素的三种检测方法，农医发【2017】1 号文件附录8，GB/T 21237-2007，农业部1025 号公告-12-2008，以鸡肉为例，经过多次反复实验，且对部分实验条件进行了优化，发现GB/T 21237-2007 的不仅实验操作方便且方法回收率较高，准确性高，能较好的满足实验要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 四环素、金霉素、土霉素的标准样品来源于农业部环境保护科研监测所；柠檬酸 (C6H8O7.H2O)、磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）、乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2Na2O8.2H2O)、氢氧化钠、浓氨水三氟乙酸均为分析纯，甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均为色谱纯，实验用水为二次蒸馏水，HLB 固相萃取柱60mg/3mL。高效液相色谱-质谱为安捷伦三重四级杆液质联用仪6460。

1.2 样品的制备和贮存 取适量新鲜或冷冻的样品中取出500g，用组织搅碎机充分搅碎均匀，装入洁净的塑料瓶中，密封，并标记，于-18℃以下冰冻存放。

1.3 样品提取和净化

1.3.1 农医发[2017]1 号文件附录8 优化后的方法提取：称取1±0.02g 试样于50mL 离心管中，加入Mclivaine-Na2EDTa （pH=5.0±0.2） 缓冲液8mL，涡动1min，超声20min，于-2℃1000r/min 离心10min，将上清液倒入另一50mL 离心管中，残渣加入磷酸盐缓冲液8mL，同样的方法提取一次，合并两次提取液，混匀，备用。

净化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取备用液过柱，依次用水5mL、20%的甲醇水溶液5mL 淋洗，减压抽干5min，控制流速1mL/min。用15mL 洗脱液（乙酸乙酯：甲醇：浓氨水=150：150：6） 洗脱，并收集洗脱液，洗脱液于45℃水浴氮气吹干，用复溶液（水：甲醇：乙腈：甲酸=40：5：5：0.05）1mL，涡动1min溶解残余物，14000r/min 离心6min，0.45um 滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 农业部1025 号公告-12-2008 鸡肉、猪肉中四环素累药物残留检测液相色谱-串联质谱法优化后的方法

提取：称取2±0.05g 试样于50mL 离心管中，加入Mclivaine-Na2EDTA （pH=4.0±0.5） 缓冲液8mL，涡动1min，-2℃8000r/min 离心10min，取上清液于另一50mL 离心管中，重复提取一次，合并提取液，混匀，备用。

净化：依次用甲醇5mL 和水5mL 活化固相萃取柱，取备用液过柱，依次用水5mL、5%的甲醇水溶液5mL 淋洗，减压抽干。用10mL 甲醇洗脱并收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用甲醇-水（3：7）1.0mL，涡动溶解残余物，0.45um 滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

1.3.3 GB/T 21317-2007 动物源食品四环素类兽药残留检测方法，液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法优化后的方法

提取：称取试样5±0.01g 于50mL 离心管中，分别加入约18mL、18mL、12mLMclivaine-Na2EDTa（pH=4.0±0.05）缓冲液冰水浴超声提取三次，每次涡动混匀1min，超声提取10min，合并上清液，并定容至50mL 混匀，-2℃5000r/min 离心10min，滤纸过滤，待净化。

净化：吸取10mL 提取液过固相萃取柱，待液体全部流出，依次用5mL 水和5mL 甲醇-水（1：19）淋洗，抽干5min，最后用15mL 甲醇-乙酸乙酯（1：9）洗脱。收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用1.0mL 甲醇-三氟乙酸水溶液（1：19）溶解残渣，0.45um 滤膜过滤，待测定。

1.4 标准溶液的配置

1.4.1 标准储备液

分别移取浓度为100ug/mL 四环素、金霉素、土霉素标准溶液0.50mL 于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并摇匀，浓度均为5ug/mL，-20℃冰箱保存。

再移取2.00mL 浓度为5ug/mL 的混合标准储备液于10.0mL 的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并摇匀，浓度为1ug/mL，-20℃冰箱保存。

1.4.2 混合标准工作液

选取不含四环素的空白组织样品，经过上述的提取净化制备空白基质液。分别添加混合浓度为1ug/mL 标准储备液 ，0.01mL，0.02mL，0.04mL，0.08mL，0.10mL，0.20mL于空白基质液中，并定容至1.00mL，配制成10.0ug/L，20.0ug/L，40.0ug/L，60.0ug/L，80.0ug/L，100.0ug/L，200.0ug/L 的基质标准液体。

表1 液质质仪器条件

1.5 上机测试

将所前处理的溶液上高效液相色谱-质谱为安捷伦三重四级杆液质联用仪6460。仪器条件如下：

色谱柱：C18 50*2.1nm

流动相：A：0.1%甲醇水溶液，B：0.1%甲酸甲醇溶液（梯度淋洗见表1）

柱温：35℃；

流速：0.2mL/min；

进样量：2uL。

1.6 结果计算

采用外标法定量，四环素类兽药残留量：X=L1*C*V/（L2*m）

X 样品中带测组份含量，单位为微克每千克(ug/kg)；

L1 样品提取体积，单位为毫升(mL)；

L2 样品移取体积，单位为毫升(mL)；

C 上机浓度测试浓度(ug/kg)；

m 称取样品的质量（g）。

2 方法比对、回收率及原因分析

2.1 提取

表2 提取方法比对

2.2 净化（三种方法所使用的均是HLB 固相萃取柱60mg/3mL）

表3 净化方法比对

2.3 回收率

以加标100ug/kg 为例，三种方法的回收率如下

表4 回收率

农医发【2017】1号文件附录8方法 在10-500ug/kg 的回收率为60%-110%，农业部1025 号公告-12-2008 方法在50-200ug/kg 的回收率为 60% -120% ，GB/T 21317-2007 在50-200ug/kg 的回收率为60%-120%；三种方法中四环素和土霉素的回收率都均能满足实验要求，GB/T 21317-2007 较其它的方法回收率略高;金霉素的差别却很大，只有GB/T 21317-2007 方法的的金霉素回收率在70%以上，综上所述，测定鸡肉中的四环素，只有GB/T 21317-2007 四环素、土霉素、金霉素回收率均能满足实验要求。

2.4 原因分析

GB/T 21317-2007 的方法较其他方法三个参数回收率都较高，主要是由于提取完后过滤，部分残渣和油脂残留在滤纸上，净化时不会堵塞固相萃取柱，以至于得到较高回收率。而其它两个方法提取完直接过固相萃取柱，残渣和油脂容易堵塞固相萃取柱，洗脱不充分，回收率低。

金霉素只有GB/T 21317-2007 方法回收率能满足实验要求，这与金霉素自身的特点有关，金霉素较易水解[9]，其分解速度与pH 和温度有关系，碱性和中性条件下水解速度明显大于酸性条件，高温条件下的水解速度明显大于室温。农医发【2017】1 号文件采取超声提取的方法，超声过程中会放热，加速了金霉素的水解，且氮吹温度45℃，同样加速了金霉素的水解，以致金霉素的回收率30%，三个方法中回收率最低；农业部1025 号公告-12-2008 方法提取至有涡动混匀，没有经过超声提取，提取不充分，因此金霉素的回收率只有43%；GB/T 21317-2007 方法中采取的是冰水浴超声提取，且离心温度设置-2℃，均能降低金霉素的水解，所以此方法金霉素的回收率能达到75%，能够满足回收率的要求。

3 实验条件优化及注意事项 （ 以GB/T 21317-2007 为例子）

3.1 样品解冻

一般样品中在-18℃以下冰箱里冰冻存放，检测样品恢复至室温后，按照标准操作方法处理，严禁用微波等加热方式对样品进行解冻，应在室温下自然解冻后再进行前处理。

3.2 离心机最优温度-2℃

由于离心机高速转动起来会放热，且部分离心机达不到设置的温度，所以一般温度设置在-2℃左右，温度太高油脂是液体状态，进入提取液，净化时时会堵塞固相萃取柱，降低回收率；温度太低，试样结冰，部分残渣会包裹在冰中，净化时时会堵塞固相萃取柱，降低回收率。

3.3 洗脱液的用量

由于固相萃取柱的厂家不同，填充的密度不同，导致固相萃取柱有差异，且部分四环素吸附在柱子上，洗脱液的量过少会致使部分四环素洗脱不完全，洗脱液量过多会洗脱出杂质，对上机有干扰造成正偏差，经过大量实验得出最优的洗脱液量15mL。以加标100ug/kg 为例，不同的洗脱液回收率如下：

洗脱液用量（mL）回收率（%）四环素 土霉素 金霉素5 51 55 25 10 68 75 40 15 80 86 75

4 结论

本文通过动物源食品中四环素的检测，农医发【2017】1 号文件附录8，GB/T 21237-2007，农业部1025 号公告-12-2008 三种方法的对比，以鸡肉为例，经过多次反复实验，且对部分实验条件进行了优化，发现GB/T 21237-2007 的不仅实验操作方便且方法回收率较高，准确性高，能较好的满足实验要求。