水产品中喹诺酮类兽药残留检测研究进展

刘海生

（广东省清远市动物疫病预防控制中心广东清远511500）

关键字：水产品；喹诺酮类；残留检测；处理方法

喹诺酮类抗微生物药是在近几十年开始发展起来的一类人工合成的广谱抗微生物药，从第一个喹诺酮类抗微生物药——萘啶酸开始，人们不断改造和开发此类药物，因为这类药物具有独特的抗微生物机制，即抑制微生物DNA 拓扑异构酶的活性，从而抑制微生物DNA 复制，最终导致微生物死亡。这种独特的抗菌机制让这类药物与其他抗微生物药物之间基本不存在交叉耐药现象，所以此类药物可与其他抗菌机制的药物联合使用，从而增强治疗效果。

随着人们生活水平不断提升，人们的消费观念和消费水平都有了很大的改变，由于水产品相较于其他动物源性食品具有其特有的营养组分和独特风味，水产品在人们饮食方面上越来越重要。据有关部门统计，2017 年全国水产品养殖总量为6,573.82 万吨，占世界水产养殖总量的70%，如此庞大的市场潜力之下隐藏着的食品安全问题也是需要高度重视的。目前，我国和欧盟都对水产品中部分喹诺酮类药物要求有最高残留限量（见表1），但是水产品中兽药残留检测的研究还不够深入，尤其是同时进行多个或多种药物的检测方法研究上，因此在多兽药残留检测的方法上还需要更进一步研究，尤其是在检测方法的灵敏度、稳定性、时效性的研究上。

表1 欧盟和中国农业部规定的最高残留限量

1 喹诺酮类药物理化性质

喹诺酮类药物属于4-喹诺酮-3-羧酸的衍生物，其化学结构式如下图所示。

图1 4-喹诺酮-3-羧酸结构

根据不同药物的化学结构式的母环结构之间的不同，这类药物可以分为萘啶酸类、吡哌酸类、喹啉酸类及氟嗪酸类，4 种类型的化学结构分别如下：

注：由A 至D 依次为萘啶酸类，吡哌酸类，喹啉酸类，氟嗪酸类。

喹啉酸类是目前研究得最多、成果最大，种类也最多的喹诺酮类药物，这类药物具有抗菌作用较强，口服吸收快，血药浓度较高，体内分布广等特点。大多数喹诺酮类药物在化学结构上的C-3 位上含有羧基基团，C-7 位上含有哌嗪或其他含氮的碱性基团，因此大多数喹诺酮类药物属于酸碱两性化合物。在中性溶液中，喹诺酮类药物一般被溶解成3 种离子形式，即阳离子、阴离子以及两性离子。正是由于这种特殊的化学结构，喹诺酮类药物容易被极性有机溶剂溶解，如乙腈、甲醇，也容易溶于冰醋酸、稀酸溶液和稀碱溶液，而在极难溶或不溶于非极性溶剂，如水、正己烷、甲苯和乙醚等溶剂。

2 喹诺酮类药物残留检测的样品前处理方法

在水产品中的兽药残留检测中，样品的前处理方法主要包括提取溶剂和净化方法两个方面，根据喹诺酮类药物的理化性质，在此类药物残留检测中，提取溶剂主要选择以下几种溶剂：

1)与水互溶的极性有机溶剂，如乙醇、乙腈、甲醇、丙酮等。一般情况下这类溶剂能够直接把喹诺酮类药物提取出来。当出现提取效果不好的时候，可以在提取溶剂中加入一定比例的酸或碱，如乙酸、甲酸、氢氧化钠等，加入酸或碱的目的可能是可以改变药物电离，以促进药物分配至有机溶剂中；

2)缓冲盐溶液，如用磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液等直接浸提；

3)不与水互溶的有机溶剂，如乙酸乙酯，原理同萃取原理，一般同时加少量入酸性或碱性溶液来提高药物在有机相的分配比例。

在药物的提取过程中，水产品样品含有较多的杂质物质，如脂肪、蛋白质、干扰离子等，这些杂质物质也会溶解在提取剂当中，如果不经过净化过程极可能对实验结果造成偏差，甚至还会对分析仪器造成严重影响，因此提取药物后需要经过一定的净化过程。

在水产品的兽药残留检测研究中，常选用的净化方法有液-液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、凝胶渗透色谱法、免疫亲和色谱法、超临界流体萃取法、分子印迹法等，各种方法优缺点如表2 所示[1]。各种样品净化方法具其独特优点，在选择方法时需要根据样品的性质和检测目标药物的性质来选择最优的净化方法，以达到最佳检测效果。

表2 部分净化方法比较

3 水产品中喹诺酮类药物检测方法

目前喹诺酮类药物残留的检测方法主要有对仪器和人员要求较低的微生物法、高效毛细管电泳法 (high performance capillary electrophoresis,HPCE)和免疫分析法(immunoassays,IAs)，以及对仪器和人员要求较高的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）、液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)、高效免疫亲和色谱法等。对仪器和人员要求较低的方法一般用于定性分析或者用于对检测结果不要太精密的检测，如用于多样品的初次筛选，而对仪器和人员要求较高的方法一般用于要求精确的定量分析。

3.1 微生物法

微生物法是一种利用指示菌株检测抗菌药物残留量的快速检测方法。抗微生物药物对敏感微生物具有良好的杀灭或抑制效果，但当抗微生物药物的浓度低到一定程度后，这种效果将表现不出来。这种方法的原理就是利用药物敏感微生物所表现的程度强弱会形成不同大小的抑菌圈，而这种抑菌圈与药物含量之间具有直接的相关性。另外由于这种方法的操作简单，实验耗时少，可同时检测大批量样品，因此常用作畜禽产品和水产品中药物残留的快速检测初筛方法。但是由于检测可能会出现假阳性结果，所以出现阳性结果的样品需重复检测，或是结合其他检测方法确定检验结果。

3.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法是1960 年开始发展起来的一门技术，它具有色谱柱分离效率高、分析速度快、待检测样品用量少、灵敏度高、自动化程度高等特点，还可以将分离、分析一次完成。目前在兽药残留检测上已经建立了许多分析方法，其中又以反相液相色谱为主。在反相液相色谱方法中，可以根据目标检测药物的特性选择合适的流动相，并通过改变流动相的组份比例、pH，或通过加入离子对试剂等方法以优化流动相的组成，从而控制保留时间和选择性[2]。

待检测样品经过液相色谱分离后，即可利用合适的检测器进行分析检测，常用的液相色谱检测器有紫外检测器、荧光检测器、二极管阵列紫外检测器以及可见分光光度检测器等。由于喹诺酮类药物对波长处于250～320 nm 范围内的光有吸收，故一般选择紫外检测器用于检测此类药物，另一方面紫外检测器是通用型检测器，适用于多类药物的分析检测。但是由于HPLC 对于多残留检测的药物种类数目有一定局限性，或对于性质相近的物质分离效果不佳，故此方法常用于单种或是少种数的药物残留分析[3]。

3.3 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法是运用液相色谱（LC）的分离原理对组份进行分离后，再以质谱仪（MS）作为检测器进行检测。这种方法对分析目标物要求不高，常用于直接分析和鉴定兽药、农药、蛋白质、多糖等物质。在兽药残留检测中，这种方法适用于检测极性、大分子、高沸点、不挥发或热不稳定的各类兽药，喹诺酮类药物完全可以用这种方法检测，而且不需要经过衍生化处理即可检测。这种方法具有选择性强、灵敏度高和可以同时检测多种药物残留等优点，所以喹诺酮类药物的多残留检测和研究经常使用这种方法。值得一提的是质谱仪除了可以与液相色谱串联使用外，还可以与高效液相色谱或是超高效液相色谱(UPLC)串联使用，从而增加色谱柱分离效果，提高检测效率[4-5]。

3.4 高效毛细管电泳法

毛细管电泳法是在近年来开始发展起来的一项新的实验分析技术，这种方法可以避免酸性或碱性的缓冲液以及其中的表面活性剂等添加剂的影响，具有操作简单、分析速度快、分离效率高、样品用量少、运行成本低等优点[6]，而且色谱柱不会被样品污染，有利于实际样品的分析。但这种方法的检测限较高，且因进样量较小而不利于灵敏度的提高，因此目前HPCE 法较少用于兽药残留分析。

3.5 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原与抗体在体外的特异性反应建立起来的检测技术，其特点是特异性高，简单快捷，检测成本相对较低，可以大批量检测，但是出现假阳性的可能性较大，所以免疫分析法在实际应用中常常被作为初步筛选的方法[7-8]。

4 总结

喹诺酮类药物在临床使用上抗菌谱广、价格低廉、使用方便，以及抗菌机制独特等特点，对预防和治疗多种由细菌、支原体及衣原体等引起的感染性疾病很有效果。然而，喹诺酮类药物在食品性水产中的残留可直接对人类造成危害，此外长期大量使用这类药物造成的低浓度的残留药物可能会对敏感致病菌产生耐药性，从而间接威胁到人类的健康。虽然我国已经出台了相关政策规定不得在水产养殖中使用一些喹诺酮类药物，但是由于这类药物良好的临床使用价值，仍会有养殖者不按休药期使用，导致水产品中含有的喹诺酮类药物超过最高残留限量，甚至还有不法养殖者铤而走险使用水产养殖禁用药，所以对水产品中喹诺酮类药物进行残留检测具有很重要的现实意义。

在水产品中喹诺酮类药物残留检测方法中，实用性最好的是高效液相色谱法，但这种方法检测成本较高，也需要有专业的检测人员来完成检测，所以在实际检测中，可以结合免疫分析法进行初步筛查后对超出残留限量的样品再用高效液相色谱进行检测，以确定样品中的药物残留量。█