中药指纹图谱研究进展

曾凡一 郑志慧 位慧芸 娄煊晨 陈小敏 李彦灵

摘要：指纹图谱作为中药质量控制的重要手段而被广泛应用，本文综述了中药指纹图谱的发展现状、建立和评估方法。

关键词：中药材；指纹图谱；建立方法

中药质量的好坏关与临床疗效的密切相关，质量的优劣是保证中药的有效性、安全性、可控性的基础[1]。考虑到中药的复杂性，中药的检测需要引入更精密的检验方法，简单的研究方式，无法得到科学精确的结果[2]。因此，随着国家对中药质量的重视，中药鉴别的方法更加多元化。指纹图谱作为综合性，全面性的研究手段，能够有效的的解决中药鉴别中的复杂问题。

中药指纹图谱是经过一定分析手段分析后，经色谱测定，得到能特异性显示某种中药化学特征的图谱。通过图谱的比对可以对中药进行真伪乃至品质进行鉴别，整体性和模糊性是中药指纹图谱的两大特点[3]。

1.指纹图谱发展史

上个世纪60年代薄层色谱技术始用于中药的鉴别，接下来的20年里薄层扫描仪也逐渐投入使用，极大地提高了中药质量检测的科学性。上个世纪60年代液相技术的使用投入商业化，90年代始载于我国药典。随着多种多样的中药鉴别手段的使用，中药指纹图谱开始提出并迅速为国际所接纳[4]。21世纪初，中药注射剂要求药材产地固定，并且其质量以指纹图谱为标准纳入国家监控[5]。

2.中药指纹图谱建立方法

2.1气相色谱（GC）指纹图谱

气相色谱法用于可气化而不分解的物质的分析，由于分离度敏感度高、选择性好等优点，使气相色谱被广泛应用卫生医药检验等方面[6]。谢建军等[7]通过气相指纹图谱的比对，指出不同产地的红酒存在差异。同时，Cao G等[8]提供了一种基于化学图谱方法的二维气相色谱/飞行时间质谱（GC×GC-TOF/MS）方法，用于鉴定晒干和硫烟熏中药中的非目标和目标挥发性化合物。研究表明，与晒干的样品相比，硫烟熏样品的主要活性成分明显流失，指纹图谱更具破坏性。此方法可用于中药及其制剂、生物样品和环境样品等多种复杂混合物中复杂的靶标和非靶标成分的鉴别。Liu W等[9]利用熵和遗传统计学原理，以鱼腥草中的石脑油為GC指纹图谱的变异系数建立了中药提取过程中平衡基团的数学模型，并对模型进行了验证。在质量控制模型空白的情况下，进一步利用菌株间H.cordata的Hardy-Weinberg平衡群来控制质量的稳定性，为中药提取和质量控制的稳态奠定了新的理论和实验基础。Guo FQ等[10]采用气相色谱-质谱（GC-MS）和亚窗口因子分析（SFA）方法测定了青蒿毛细血管的挥发性化学成分，测定其中的89.03%，然后用该图谱用正交投影法鉴定得到良好的一致性。Wang Z等 [11]利用GC-FPS技术，由样品的气相色谱相对保留值指纹图谱，检验了进口檀香精油的质量。

2.2高效液相（HPLC）指纹图谱

与传统液相相比高效液相利用高压液泵提高液体流动相的流速，为提高柱效采用多孔微粒固定相，柱子后有小而精密的检测器。高效液相色谱仪的使用导致了高效液相色谱法的出现[12]。徐佳等[13]测定10批水蛭药材的高效液相色谱指纹图谱得到10个共有峰，其中两个为黄嘌呤和次黄嘌呤的色谱峰，该方法为水蛭药材的质量评价提供了实验数据基础。不局限于动物药，Chen LY等[14]建立了铁线莲茎叶的高效液相色谱指纹图谱，通过指纹图谱与对照品的比对，其中5个峰分别被鉴定为维菌素-1、栀子苷、异黄酮、异栀子苷和异栀子苷。将指纹图谱、模式识别与单标记法技术相结合，彼此互为对照，为铁线莲的质量控制和评价提供更为全面的参考。关于中药茯苓指纹图谱的研究也很多，Zhu LX等[15]通过对中国四个主要产地采集的25个供试样品进行UHPLC-QTOF-MS/MS指纹图谱研究，建立了茯苓的标准指纹图谱。对指纹图谱中的23个共有峰进行了定性和初步鉴定，同时采用主成分分析（PCA）、监督正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和层次聚类分析（HCA）对指纹图谱中的特征峰进行了定性和定量分析。将25批PCS样品分为四组，与四个地理区域高度一致。筛选出10种化合物作为鉴别PCS质量的潜在标志物，利用分子生物学方法同时测定了9种三萜酸。还有对中药成方制剂的指纹图谱研究[16]。

2.3高效毛细管电泳（HPCE）指纹图谱

以毛细管为分离通道，以电渗流为驱动力，毛细管电泳技术是一类依据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异实现分离的一类液相分离技术[17]。同时，毛细管电泳的仪器简单操作方便，实验成本低。例如，蔡梅超等[18]采用高效毛细管电泳法，测量莱菔子中介子碱含量。最终，芥子碱在0.2～ 1.0m g/m L内呈良好的线性关系。陈乃东等[19]，用PMP-HPCE检测5个石斛样品。不同种源间的石斛共检测到木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和核糖等6种单糖。接着，在10个不同批次同一种源的铁皮石斛样品的HPCE指纹图谱有很高的相似性。Ma Xiao-Li等[20]将杂聚糖变成单糖。杂聚糖水解后，与1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）衍生出单糖，然后用HPCE和HPLC进行分离，并比较了二者的差异。通过标准曲线、精密度、重现性、稳定性和回收率等多项指标，两种方法的结果基本一致。异黄酮成分的检测与鉴定，对于葛根作为药用植物的利用，以及对异黄酮次生代谢定量分析的研究具有重要意义。Fang C等[21]建立了一种高效毛细管电泳（HPCE）-二极管阵列检测（DAD）分离测定葛根样品中异黄酮的方法。最终葛根样品中异黄酮含量的RSD小于5%。

2.4紫外光谱指纹图谱

由于紫外光谱法操作简单，分析速度快，对于中药种类及真伪的鉴别有广泛的应用[22]。贺正全等[23]利用紫外光谱法鉴别大黄的真伪，真伪大黄的紫外光谱指纹图谱存在差异。Wang YZ等[24]采用紫外光谱法对三七进行研究。采用均值法、平滑法和导数法对10个地区采集的50份三七样品进行紫外光谱分析。通过紫外光谱特征与偏最小二乘判别分析（PLS-DA）相结合的方法，研究了三七不同产地样品间的差异及相互关系。结果表明，主要成分与采集区域相关性较低，而含量可能受采集区域的影响。多组分析方法和指纹图谱被认为是药理学/生物勘探研究中从中草药提取物中筛选候选中草药的有效手段。Liang X等[25]用紫外光谱作为光谱指纹图谱来表征样品的化学特性。以主成分分析（PCA）和典型相关分析（CCA）为评价工具，建立了药理学数据与光谱数据的相关性，建立了评价中药解热作用的光谱指标。用紫外光谱第一正则相关变量U（1）确定的15个校准和4个验证CHM样品的药效序列与药理学实验结果一致。

2.5核磁共振氢谱指纹图谱

核磁共振利用中药材有效成分中特定的原子，用其吸收电磁的辐射进而得到这种药材的核磁共振指纹图谱。核磁共振氢谱进样量少检测速度快，接着通过分析将图谱中的谱线进行识别，来实现中药的质量监控[26]。张培成等[27]从连翘及苍术中分离获得了一系列2-O取代苯乙醇昔类化合物和具有链状邻二醇片段的烯炔普类化合物，在对这两类化合物绝对构型确定的过程中，成功利用核磁共振氢谱建立了快速准确的判断方法，由于不需要对苷类化合物进行水解，极大地缩短了实验流程。Li J 等[28]采用NMR指纹图谱结合多因素分析，款冬花花蕾在不同时期次生代谢产物和初级代谢产物上的差异，此举揭示了只有花蕾才能用作草药的内在原因。这些结果有助于了解款冬花传统使用的合理性。Jiang M等 [29]采用NMR代谢指纹图谱和多元分析相结合的方法，对采自山西（野生）和甘肃（栽培）的两个不同的黄芪进行了化学成分的比较。结果表明，山西（野生）和甘肃（栽培）的两个不同的黄芪在初级代谢产物与次生代谢产物中都存在显着差异。基于1H -核磁共振（NMR）的应用，代谢组学被用于区分三种相关的人参物种的水提取物：人参（中国两个不同的栽培区）、三七和西洋参。水煎后，Chan PH等[30]对中国河北和吉林栽培的人参水提取物进行了1H NMR代谢谱分析。光谱中，几个鉴别特征存在显著差异。1H -核磁共振（NMR）技术的应用，适用于人参产品的认证和质量控制。Lin WN等[31]通过1H-NMR光谱对栽培年限为1 - 6年的干燥人参样品进行了化学指纹图谱研究。然后，通过使用主成分分析和聚类分析来分析得到的数据集，建立一个分布模型，该模型允许基于植物代谢组学策略来识别人参的实际栽培年龄。用于各种干白人参样品和商品的实际栽培年龄评估。

2.6薄层色谱

中药材的鉴别手段中，薄层色谱法是一种简便、快速、直观、易重复的鉴别方式。2010版药典中，82.77%的药材都使用了薄层色谱进行鉴别[32]。朱迪等[33]利用TLC指纹图谱，将30批不同的天麻药材，通过聚类分析将药材分成5类，主成分分析把药材分成了6种，用以区分天麻产地。Gebrehiwot M等[34]采用水蒸气蒸馏法提取树脂，再用甲醇从果渣中提取精油，并对树脂进行过滤。通过薄层色谱层析来研究没药的抗炎和抗菌作用，验证了香没药具有真正的伤口愈合活性，支持植物的传统使用。Wei FH等[35]将夏天无薄层色谱中6个明显峰的面积与同一色谱中延胡索乙素的峰面积进行了比较，结果表明在同一色谱条件下，六个明显峰的面积与dl-延胡索乙素的峰面积相同。测定各峰的相对危险度（RR）和相对面积，以评价夏天乌的质量，并对其进行鉴别。

3.中药指纹图谱评价方法

中药指纹图谱自上个世纪90年代为国际组织所认可，在我国的发展至今已有20余年。中药色谱指纹图谱的相似性评价方法，在促进了中药产业的技术创新和中药质量标准的进步这一过程中发揮了重要作用。根据近30年来有关色谱指纹的文献数量和研究趋势，色谱指纹评价可分为三个阶段：直接比较阶段（1988 - 1999年）、相似性评价阶段（2000 - 2009年）和相似性评价发展阶段（2010 - 2017年）[36]。其中最主要的方法还是峰重叠率法，相关系数法，向量夹角余弦。近十几年也出现了化学模式识别、相似度评价法、总量统计矩法等新方法[37]。

4.展望

利用指纹图谱检验中药，正在逐步变成中药检验的标准方法。但由于不同地区、不同环境、不同采摘时期对中药的质量存在影响，难以建立统一的标准，因此中药材指纹图谱库的建立是必要的。同时指纹图谱的建立，应该以中医基础理论为指导，建立图谱与药效之间的关系，使中医药为更多人所接受。

参考文献：

[1]笪舫芳，戴忠华，朱华.中药品质评价研究现状及发展趋势[J].中华中医药学刊，2017，35（06）：1485-1488.

[2]魏萍.中药质量控制方法的研究进展[J].临床合理用药杂志，2011，4（02）：157-158.

[3]何文斐，李士敏.中药色谱指纹图谱的研究进展[J].时珍国医国药，2003，14（4）：238-239.

[4]卢剑辉，陈玉谊.中药指纹图谱应载入《中国药典》[J].海峡药学，2003（05）：59-60.

[5]谢培山.刍议中药指纹图谱的现状、发展和问题[J].中药材，2007（03）：257-259.

[6]李强，杜思邈，张忠亮，等. 中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44（22）：3095-3104.

[7]谢建军，陈小帆，陈文锐，等. 气相色谱指纹图谱法进行红葡萄酒产地溯源表征[J].食品科学，2013，34（18）：253-257.

[8]Cao G，Cai H，Cong X，Liu X，Ma X，Lou Y，Qin K，Cai B .Global detection and analysis of volatile components from sun-dried and sulfur-fumigated herbal medicine by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry.Analyst 2012 Aug；137（16）：3828-35.

[9]Liu W，Zhang X，He F，Zhang P，Wang H，Wu D，Chen Z Study on balance group in steady-state extraction process of Chinese medicine and experimental verification to Houttuynia cordata.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2011 Nov；36（21）：2950-5

[10]Guo FQ，Liang YZ，Xu CJ，Huang LF，Li XN .Comparison of the volatile constituents of Artemisia capillaris from different locations by gas chromatography-mass spectrometry and projection method.J Chromatogr A 2004 Oct；1054（1-2）： 73-9

[11]Wang Z，Hong X .[Comparative GC analysis of essential oil in imported sandalwood].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 1991 Jan；16（1）：40-3，64

[12]白梓靜.高效液相色谱在中药含量测定中的应用[J].分析仪器，2014（06）：8-11.

[13]徐佳，杨瑶珺，刘晓帆，等. 水蛭的高效液相指纹图谱研究[J].环球中医药，2013，6（08）：596-599.

[14]Chen LY，Cheng XX，Tang XM，et al. Quality evaluation of Desmodium styracifolium by fingerprint，pattern recognition combined with quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2018 Aug；43（16）：3322-3328.

[15]Zhu LX，Xu J，Wang RJ，et al. Correlation between Quality and Geographical Origins of Poria cocos Revealed by QualitativeFingerprint Profiling and Quantitative Determination of Triterpenoid Acids[J]. Molecules. 2018 Aug 31；23（9）. pii：E2200.

[16]Zhou L，Sun Z，Xue WH，et al. Quality control of Dandeng Tongnao Ruanjiaonang based on UPLC fingerprint combined with chemical pattern recognition[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2018 Aug；43（16）：3279-3284

[17]J.J，Liu S P，Wang Y T.Optimization for quantitative d etermination of four flavonoids in Epimedium by capill ary zone electrophoresis coupled with diode array dete ction using central composite design.Journal of Chroma tography A，2006，11（3）：344–349.

[18]蔡梅超.高效毛细管电泳法测定莱菔子中芥子碱含量[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（9）：45

[19]陈乃东，孟云飞，姚厚军，曹彩芸，陈辰，李俊.柱前衍生化HPCE法测定不同种源石斛中多糖的单糖组成[J].中药材，2015，38（08）：1607-1610.

[20]Ma Xiao-Li，Song Feng Feng，Zhang Hui，Huan Xie，Li Song Ya. Compositional Monosaccharide Analysis of Morus nigra Linn by HPLC and HPCE Quantitative Determination and Comparison of Polysaccharide from Morus nigra Linn by HPCE and HPLC.[J]. Current pharmaceutical analysis，2017，13（5）.

[21]Fang C，Wan X，Tan H，Jiang C.Separation and determination of isoflavonoids in several kudzu samples by high-performance capillary electrophoresis（HPCE）.[J].Ann Chim 2006 Jan-Feb（1-2）： 117-24

[22]宁泽琼，陆杨，赵立本. 紫外光谱法在中药鉴定中的应用[J].民营科技，2014（09）：56.

[23]贺正全，李九丹. 紫外光谱法鉴定大黄及其伪品[J].中药通报，1988（04）：9-10

[24]Wang YZ，Zhong G，Zhang J，Zhao YL，Yang TM，Zhang JY .Discrimination of Panax Notoginseng from Different Regions by UV Spectra Characteristics Combined with Chemometric Method.[J].Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 2016 Jun；36（6）：1789-93

[25]Liang X，Zhang L，Zhang X，Dai W，Li H，Hu L，Liu H，Su J，Zhang W .Qualitative and quantitative analysis of traditional Chinese medicine Niu Huang Jie Du Pill using ultra performance liquid chromatography coupled with tunable UV detector and rapid resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight tandem mass spectrometry.J Pharm Biomed Anal 2010 Feb；51（3）： 565-71

[26]秦海林，赵天增.核磁共振氢谱鉴别植物中药的研究[J].药学学报，1999（01）：59-63.

[27]张培成. 核磁共振氢谱在天然产物结构解析中的应用[A]. 中国药学会（Chinese Pharmaceutical Association）.2017年中国药学大会暨第十七届中国药师周资料汇编[C].中国药学会（Chinese Pharmaceutical Association），2017：1.

[28]Li J，Zhang ZZ，Lei ZH，Qin XM，Li ZY NMR based metabolomic comparison of the antitussive and expectorant effect of Farfarae Flos collected at different stages .[J].J Pharm Biomed Anal 2018 Feb；150 377-385

[29]Jiang M，Jiao Y，Wang Y，Xu L，Wang M，Zhao B，Jia L，Pan H，Zhu Y，Gao X .Quantitative profiling of polar metabolites in herbal medicine injections for multivariate statistical evaluation based on independence principal component analysis.PLoS One 2014；9（8）：e105412

[30]Chan PH，Zheng KY，Tsim KW，Lam HMetabonomic analysis of water extracts from Chinese and American ginsengs by 1H nuclear magnetic resonance：identification of chemical profile for quality control.Chin Med 2012 Nov；7（1）：25.

[31]Lin WN，Lu HY，Lee MS，Yang SY，Chen HJ，Chang YS，Chang WT .Evaluation of the cultivation age of dried ginseng radix and its commercial products by using（1）H-NMR fingerprint analysis.Am J Chin Med 2010；38（1）：205-18

[32]姜潇，黄湘鹭，曹进，等. 款冬花薄层色谱药典方法改进及对药典中薄层方法应用的思考[J].中国中医药现代远程教育，2012，10（17）：156-158.

[33]朱迪，谭丹，谢玉敏，等.不同产地天麻药材薄层色谱指纹图谱分析[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（05）：75-78.

[34]Gebrehiwot M，Asres K，Bisrat D，Mazumder A，Lindemann P，Bucar F . Evaluation of the wound healing property of Commiphora guidottii Chiov. ex. Guid. BMC Complement Altern Med 2015 Aug；15 282.

[35]Wei FH，Zhang JJ，Zhang L . Study on the TLC-fingerprint of Xiatianwu. Zhong Yao Cai 2006 Jun；29（6）： 547-50.

[36]Zou CC，Yan HY .Research progress on chromatographic fingerprint similarity evaluation method for traditional Chinese medicine in the past 30 years（1988-2017）and its prospecZhongguo Zhong Yao Za Zhi 2018 May；43（10）：1969-1977

[37]孙国祥，闫波，侯志飞，等.中药色谱指纹图谱评价方法研究进展[J].中南药学，2015，13（07）：673-681.

项目经费来源：校级科技创新团隊（新药研发科技创新团队，编号STD201602）

第一作者简介：曾凡一（1999-），男，汉，河南信阳人，新乡医学院三全学院16级药学本科在读。

通讯作者简介：李彦灵（1987-），女，汉，河南辉县人，硕士学位，助教。研究方向：天然药物化学。