水蛭胶囊薄层鉴别及次黄嘌呤含量测定的研究

刘明智 黄光磊 张钰祺 易徐航 袁娟丽

摘要：目的 建立水蛭胶囊薄层鉴别及次黄嘌呤含量测定方法。方法 采用薄层色谱法以水蛭对照药材对水蛭胶囊进行定性鉴别；以高效液相色谱法对其中的次黄嘌呤进行含量测定：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水（5：95）为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃。结果 水蛭胶囊供试品的薄层色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，可以作为水蛭胶囊的鉴别方法；高效液相色谱法中，次黄嘌呤的进样浓度在2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）范围内呈良好线性关系；次黄嘌呤的平均回收率（n=6）分别为98.3%（RSD%=0.5）；5个批次水蛭胶囊样品中次黄嘌呤的含量测定结果分别为100.0μg/袋，104.7μg/袋，97.6μg/袋、101.5μg/袋、103.7μg/袋。结论 本文建立的方法经方法学验证，结果准确、可靠，可用于评价水蛭胶囊质量。

关键字：水蛭胶囊，薄层色谱法，高效液相色谱法，次黄嘌呤，含量测定

[ABSTRACT] Objective To establish a qualitative identification method and a HPLC method for the determination of hypoxanthine in Shuizhi Capsule.Methods TLC was employed to make qualitative identification of Hirudo in Shuizhi Capsule and HPLC was used to determine the content of hypoxanthine in Shuizhi Capsule：The analytical column was Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），methanol-water（5：95）as mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min and the detection wavelength was 254nm，The column temperature was 25℃.Results The spot in the chromatograms of Shuizhi Capsule were in the same location and color with those in the chromatograms of standard hirudo and the result showed that the method has good durable ability.The linear range for hypoxanthine was 2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）. The average recoveries（n=6）were 98.3%（RSD%=0.5）for hypoxanthine.The contents in 5 sapmles of Shuizhi Capsule were 100.0μg/bag，104.7μg/ bag，97.6μg/ bag、101.5μg/ bag、103.7μg/ bag.Conlusion The method is accurate and reliable，and it can be applied to the quality control of Shuizhi Capsule.

[Key words] Shuizhi Capsule；TLC；HPLC；hypoxanthine；determination

水蛭最早收载于《神农本草经》[1]，是一味具有强效破血逐瘀的虫类药，对血液动力等方面有积极的改善作用[2-3]。因其疗效确切，为历版《中国药典》所收载[4]。《中国药典》收载的水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmannia acranulata Whitman的干燥全体[5]。水蛭含有多种有效成分，主要含有两类：一类是以水蛭素为代表的多肽及蛋白类大分子成分；另一类是蝶啶等小分子化学成分[6]。水蛭“夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥[5]。”但水蛭素在80℃条件下15min能将其破坏[7]，即水蛭饮片中水蛭素已被破坏。次黄嘌呤是水蛭所含的有效成分之一，是核酸的代谢产物，广泛存在于动植物中，具有平喘、舒张支气管、降压等药理作用，其作为有效成分指标测定其含量的研究广泛[8-9]，已有报道测定水蛭饮片中次黄嘌呤的含量[10]。水蛭胶囊为医疗机构制剂，为单方制剂，其质量标准由江西省食品药品监督管理局颁布，标准号为GZJ-0296-（1）-2006，其正文内容并无鉴别方法和含量测定方法。本文对水蛭胶囊采用薄层色谱法（TLC）进行了定性鉴别、采用高效液相色谱（HPLC）法对其主要成分次黄嘌呤进行了含量测定。方法简便易行，结果准确可靠，建立了水蛭胶囊的质量控制的有效方法，也为含水蛭成方制剂的质量研究提供了重要参考。

1仪器与试药

1.1仪器：1200高效液相色谱仪（美国安捷伦）；ME-204万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；CP225D十万分之一电子天平（赛多利斯）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。

1.2 试药：水蛭中药材对照品（中国食品药品研究检定院，批号：121061-201305）；次黄嘌呤（中国食品药品研究检定院，批号：140661-200903，含量：99.5%）；水蛭胶囊样品（五批，萍乡市中医院制剂室提供，批号分别为：20150704；20150103；20160611；20170102；20170904）；薄层层析硅胶G（产地：东洋化工有限公司分厂，批号：0140121）；乙腈（HPLC級，购于北京百灵威科技有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

2方法及结果

2.1 薄层色谱法鉴别水蛭胶囊中水蛭

取水蛭对照药材细粉lg，加乙醇5ml，超声处理15min，滤过，取滤液作为对照品溶液。取本品内容物粉末lg，同法制成供试品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版第四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10% 硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。

2.2 HPLC法测定水蛭胶囊中水蛭含量

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）柱，以甲醇-水（5：95）为流动相，检测波长为254 nm；流速：1.0 ml/min，柱温：25 ℃，进样量10μl。理论塔板数按次黄嘌呤峰计算，不得低于3000。

2.2.2 溶液的制备（1）对照品溶液 取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液。（2）供试品溶液 取装量差异项下本品内容物，混匀，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，称定重量，超声处理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。

2.2.3. 专属性试验

取次黄嘌呤对照品，按2.2.2项下对照品溶液的制备方法制备对照品溶液和供试品溶液。精密量取上述两种10μl注人液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液和供试品溶液中，主峰对称因子以及与其他杂峰分离度均符合规定，理论踏板数按照次黄嘌呤计为22416。色谱图见图1。

2.2.5 线性范围考察

取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取适量，用甲醇稀释至浓度为2.67、5.34、10.48、21.35、42.70、85.40μg/ml的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以对照品的浓度（X，μg/ml）为横坐标，相应的峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程Y=0.0223X+0.0718，r =0.9999，线性范围为26.7μg～854.0μg。

2.2.6 系统精密度试验

精密吸取次黄嘌呤对照品溶液10μl，按2.2.1项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积，计算次黄嘌呤峰面积的RSD为0.2%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验

取同一批号样品（批号：20160611）共6份，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按照2.2.1项下测定次黄嘌呤的含量，计算得次黄嘌呤含量分别为98.2μg /粒、97.7μg /粒、97.5μg /粒、98.7μg /粒、98.1μg /粒、98.0μg /粒，RSD为0.4%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 溶液稳定性试验

取供试品溶液（批号：20160611），室温保存，按2.2.1下色谱条件，分别于0、2、4、8、12h精密吸取10μl进样，测定次黄嘌呤的峰面积，峰面积的RSD为0.3%（n=5），表明供试品溶液在室温下12h内稳定。

2.2.9 加样回收实验

取本品（批号：20160611）适量，精密称定，分别加入取次黄嘌呤适量，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备同一浓度（相当于100%浓度水平）供试品溶液共6份，精密取10μl注人液相色谱仪，记录色谱图；另取次黄嘌呤对照品，按2.2.2项下对照品溶液的制备方法制备对照品溶液，同法测定。记录色谱图，计算回收率。可接受的回收率应在90～110%，本品含量测定的平均回收率为98.3%，RSD=0.5%，表明含量测定方法的回收率良好，测定结果见表1。

2.2.10 样品测定

取装量差异项下本品内容物，混匀，研细，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，称定重量，超声处理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，精密取10μl注人液相色谱仪，记录色谱图；另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，既得。记录色谱图，量取峰面积，按外标法计算样品的含量。三批样品的含量测定结果见表2。

3 讨论

《中国药典》2015年版一部水蛭中药材及其饮片的含量测定法采用的是生物测定法[5]，所需的凝血酶试剂价格昂贵且不易保存，且检测时操作稍复杂。次黄嘌呤相对稳定，提取方法相对简单 [11]，其广泛存在于动植物中。本文采用薄层色谱法对水蛭胶囊进行定性，结合高效液相色谱法对其主要成分次黄嘌呤的含量进行测定，可有效控制水蛭胶囊的质量。

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