试论人为添加非蛋白质氮乳与乳制品中蛋白质含量的测定方法

齐玉

摘 要：在测定乳制品蛋白质含量的方法中，传统的凯氏定氮法无法甄别人为添加非蛋白氮的劣质乳制品，给一些不法生产者提供了可乘之机，让劣质乳制品流入市场。文章对乳和乳制品蛋白质含量的检测方法进行研究，分别采用凯氏定氮法和双缩脲比色法两种方法检测乳制品中蛋白质含量，对比分析其具体测定过程及结果，为相关食品检验工作提供参考。

关键词：人为添加;非蛋白质氮乳;乳制品;蛋白质含量;测定方法

1 前言

近年来，不法商贩依靠向乳与乳制品中添加非蛋白质氮通过检验的案例时有发生。最恶劣的一次是某品牌奶粉添加了三聚氰胺物质，对消费者的身体健康造成极大伤害。为防止此类事件再次发生，必须实现对非蛋白质氮和乳制品蛋白质检测的有效区分，从而准确测定乳制品中的蛋白质含量，杜绝劣质产品进入市场。

2 乳制品中蛋白质含量测定概述

乳蛋白中含有多种人体必需氨基酸，是乳制品中的重要营养成分，因此蛋白质含量是检验乳制品质量的重要指标，GB 25190-2010中规定牛乳蛋白含量不低于0.029 g/g，GB 19644-2010中规定调制乳粉蛋白含量不低于0.165 g/g等，乳制品蛋白含量的准确测定是乳制品产品安全的重要保障[1]。蛋白质含量的测定方法有很多种，传统的测定方法多为凯氏定氮法，該方法由丹麦科学家率先提出，一直沿用至今。凯氏定氮法的测定原理是利用样品中蛋白质在催化加热的条件下分解产生的氨与浓硫酸反应，生成硫酸铵，碱化蒸馏使氨游离，经硼酸吸收后用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量，再乘以转换系数，确定蛋白质含量。但是该方法并不能给出真实的蛋白质含量，由于含氮有机物不仅仅有蛋白质，还有三聚氰胺等，凯氏定氮法并不能对两者进行准确区分。因此，一些不法生产者为谋取高额利润，人为的在乳制品中添加尿素、三聚氰胺和化肥等非蛋白质氮，以提高蛋白质含量检测数值，使劣质产品也能通过乳制品蛋白质检验。在《乳与乳制品蛋白质的测定——双缩脲比色法》（NY/T1678-2008）中规定了另一种乳制品蛋白质测定方法，即双缩脲比色法[2]。其原理是，利用三氯乙酸沉淀样品中的蛋白质，在碱性条件下，含肽键化合物与铜离子反应生成紫红色络合物，将其在540 nm下进行吸光度测定，采用外标法定量，计算蛋白质含量。这种方法可以排除尿素、三聚氰胺等人为添加非蛋白氮的影响，蛋白质含量测定结果更加准确。

3 测定材料及方法

3.1 材料与试剂

试验所需材料与试剂包括以下几种。①凯氏定氮法所需的材料与试剂。市购液态奶，纯度高于99%的酪蛋白标准品，水解蛋白、尿素、三聚氰胺、甘氨酸、95%乙醇、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、硼酸溶液、甲基红、溴甲酚绿、氢氧化钠溶液及盐酸。②双缩脲比色法所需的材料与试剂。市购液态奶，95%乙醇、浓硫酸、盐酸、硫酸铜、氢氧化钾、硫酸钾、氢氧化钠、三氯乙酸、甲基红、四氯化碳及溴甲酚绿等。所用试剂皆为分析纯，试验用水为三级水。

3.2 仪器与设备

采用凯氏定氮法和双缩脲比色法对乳制品蛋白质含量进行测定，需要采用感量为1 mg的分析天平、消煮炉、自动凯氏定氮仪、离心机、超声波清洗器和分光光度计等。

3.3 方法与过程

3.3.1 凯氏定氮法对乳制品蛋白质含量的测定

在样品前处理过程中，用分析天平准确称取2 g液体乳，共需要5份，向其中4份分别加入水解蛋白、尿素、三聚氰胺和甘氨酸各10 mg，再加入6 g硫酸钾、0.4 g硫酸铜、20 mL浓硫酸，在消煮炉中消化、放冷。然后取等量硫酸钾、硫酸铜和浓硫酸做空白试验。在测定过程中，首先在消化管中加50 mL水，然后于自动凯氏定氮仪上进行自动加液、蒸馏，滴定并记录数据，完成试验后，用公式X=[（V1-V2）×c×0.014]/m×F×100对蛋白质含量进行计算。其中V1为盐酸标准滴定液体积，V2为空白试剂消耗的盐酸标准滴定液体积，c为滴定溶液浓度，m为试样质量，F为蛋白质换算系数。

3.3.2 双缩脲法对乳制品蛋白质含量的测定

称取液体乳后，向其中分别添加水解蛋白、尿素、三聚氰胺和甘氨酸各10 mg，在50 mL离心管中加入10 mL三氯乙酸混匀。静止10 min后，在10 000r/min的转速下离心10 min。然后倾去上层清液，经10 mL 95%乙醇洗涤，向沉淀加入20 mL双缩脲试剂和2 mL四氯化碳，经过超声波清洗器振荡溶解，显色10 min后再次离心处理20 min。取上层清液，在540 nm下对其的吸光度进行测定，绘制标准曲线，计算蛋白质含量，计算公式为X=2c/m0，其中X为样品蛋白

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质含量，单位是g/g，C为蛋白质的质量浓度，单位是mg/mL，m0为样品质量，单位为g。

4 测定结果分析

4.1 双缩脲比色法

采用上述方法完成试验后，可以绘制酪蛋白标准测定曲线。结果显示酪蛋白的质量浓度在0.2～3.0 mg/mL范围内，与溶液吸光度值的线性关系较好。

4.2 凯氏定氮法

采用凯氏定氮法测定的各组非蛋白质物质添加量如表1所示。

4.3 不同方法的测定结果对比

采用不同方法对乳制品蛋白质含量进行测定的结果如表2所示，从结果来看，传统凯氏定氮法测定未添加非蛋白氮样品的结果为0.031 8 g/g，双缩脲比色法的测定结果为0.031 4g/g。凯氏定氮法测定加入非蛋白氮样品的结果则明显高于双缩脲比色法的测定结果，其测定结果在0.041 8～0.045 6g/g范围内，而双缩脲比色法在0.031 0～0.032 2 g/g范围内。

基于食品检验结果的准确性、科学性的考虑，为了避免人为添加了非蛋白质氮的劣质乳制品蒙混过关，必须采用有效的测定方法，对乳与乳制品中蛋白质含量进行准确测定。从而排除添加水解蛋白、尿素、三聚氰胺等物质对蛋白质含量测定结果的影响，分析上述实验结果，双缩脲比色法对蛋白质含量的测试结果优于传统的凯氏定氮法，规避了传统检验方法的弊端，完善了乳制品检测机制，为营造更安全的乳制品市场提供重要保障。。因此，针对人为添加非蛋白质氮这种违规违法行为的存在，采取能够区分两者的测定方法是十分必

要的。

5 结语

综上所述，传统采用的凯氏定氮法实际是对总氮含量的测定，无法区分非蛋白质氮和蛋白质氮，因此难以对人为添加非蛋白质氮的行为加以识别和控制。通过采用双缩脲比色法进行乳制品蛋白质含量的测定，可以解决这一问题，保障乳与乳制品食品安全检测的有效性。

参考文献

[1]刘琳，郑波.电流法测定乳制品中真蛋白含量的方法探究[J].中国卫生检验杂志，2016，26（14）：2013-2014.

[2]刘庆，王凡余，李刚.乳制品中蛋白质检测方法的研究进展[J].生命科学仪器，2014，12（Z1）：43-46.