6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用

刘 云，朱善元，龚祝南，秦 枫，夏文龙，吴 双，吴晓洁

(1.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300； 2.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210000)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸障碍的高度传染性疾病，能引起猪分娩率降低、晚期堕胎，以及死胎数量增加等问题，对全球经济造成了严重的影响[1]。目前，对该病的主要防治手段是接种疫苗。市面上的PRRSV疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但是这2种疫苗均存在免疫效果差和安全性低等问题[2]，因此，急需开发安全有效的针对PRRSV的特效药物。

近年来，已有许多学者研究了中药抗PRRSV的作用，发现很多中药具有较强的抗病毒活性。中药对病毒具有多重作用，毒副作用小且很少产生耐药性，一些中药还具有解热、增强机体免疫功能等优势。PRINGPROA等[3]研究了狗牙根提取物体外抗PRRSV的作用，发现质量浓度为0.78 mg/mL的狗牙根粗提物可使PRRSV失活并在体外抑制PRRSV的复制。孙加节等[4]研究发现，人参多糖在体外可有效阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染，可作为预防和治疗PRRSV的候选药物。胡安君等[5]、刘樱等[6]、汪志等[7]还发现，甘草酸、黄芪、葛根连芩提取液在体外对PRRSV也有抑制作用。

荆芥具有抗痉挛、利尿、平喘、镇咳等功效，可用于儿童皮疹、蛇和蝎子等动物咬伤后的局部治疗[8]，其药理作用在国内研究较少，国外也主要研究其挥发油成分的药理作用[9]。委陵菜可清热解毒、止血、止痢，目前对其药理学作用的研究较少。啤酒花具有抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗疟原虫等多种生物活性[10]，可用于治疗消化不良、浮肿、小便淋痛、失眠、痢疾、结核、麻风等[11-12]。翻白草是一种多年生草本，具有清热、解毒、止血、消肿的功效。刘蕾等[13]研究发现，翻白草油能增加感染呼吸道合胞病毒细胞的存活率，且有一定的剂量依赖性。百部的主要活性成分为百部生物碱，具有驱虫、杀虫、镇咳平喘、抗肿瘤和抗菌等作用[14]。虎杖具有利胆退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效[15]，SEMPLE等[16]报道了2型和3型小儿麻痹病素能够被虎杖中的大黄酚显著地抑制。荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖均具有清热解毒的功效，但目前尚未有关于这6种中药抗PRRSV的研究。为此，选取这6种药物，研究它们体外抗PRRSV的作用，以寻找出有效预防和控制PRRS的措施。

1 材料和方法

1.1 细胞与病毒

Marc-145细胞、PRRSV SH1705毒株、病毒滴度为105TCID50/mL的PRRSV SH1705病毒液、针对PRRSV ORF7编码序列的特异性引物(F:5′-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3′，R:5′-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3′)、拷贝数为4.34×109的pMD-ORF7标准质粒均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 DMEM培养液(Hyclone公司)、PBS(上海培源公司)、青链霉素混合液(100×)(Solarbio公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Solarbio公司)、病毒核酸纯化试剂盒(TaKaRa公司)、逆转录试剂盒(TaKaRa公司)、染料法荧光定量试剂盒(TaKaRa公司)、噻唑蓝(MTT)(Sigma公司，用PBS溶液配制成2 mg/mL，用前新鲜配制)。

1.2.2 主要仪器 生物安全柜(MVE公司)、酶联免疫检测仪(Bioteck公司)、CO2培养箱(NVAIRE公司)、ABI 7300(Thermo公司)、倒置荧光显微镜(Olympus公司)、-80 ℃ 超低温冰箱(Thermo公司)。

1.3 中药提取

用传统水煎煮法对荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖这6种中药进行提取。每种中药称取10 g，加10倍水浸泡过夜，煎煮2次，每次30 min，合并滤液，浓缩至1 g/mL，真空干燥，称质量，计算得率，并置于干燥器保存备用。

1.4 药物安全性测定

1.4.1 Marc-145细胞培养 取出冻存的细胞，拧紧管盖，立即置于37 ℃恒温水浴锅中，不停摇动使其快速融化。将该细胞转入含有预热的完全培养基的离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，用预热的完全培养基将其重悬后加入细胞培养瓶中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，细胞长至单层后进行消化，传代备用[17]。

1.4.2 药物安全性试验 采用MTT法检测药物对细胞的抑制率，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其OD值，根据OD值计算细胞生长抑制率[18]。

将细胞瓶中长至单层的细胞消化后计数，用含10% FBS的DMEM稀释至约2×105个/mL，加入96孔板,每孔100 μL细胞悬液。待细胞长至单层后，弃去培养液，第1～10列依次从低质量浓度至高质量浓度加入稀释药液，每个质量浓度重复4孔，每孔100 μL,11～12列加入细胞培养液作为细胞对照,置于 5% CO2、37 ℃培养箱中。培养72 h后，弃去药液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 mg/mL),50 μL/孔，培养4 h后，弃去MTT溶液，加入DMSO完全溶解结晶，测OD490值。计算生长抑制率：生长抑制率=(细胞对照组OD490值-药物组OD490值)/细胞对照组OD490值×100%。

1.5 PRRSV病毒滴度测定

1.5.1 PRRSV的扩增 将细胞瓶中长至单层的细胞消化后，弃去旧培养液，用 PBS洗2 遍。用含2% FBS的DMEM培养液稀释 PRRSV，接种病毒液至细胞中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每天观察，当出现80%～90%细胞病变时，终止培养。将病变细胞在-80 ℃与4 ℃反复冻融3次后，收集细胞悬液，5 000 r/min离心5 min，收集上清液[19]，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装至EP管内，标注好分装时间与批次等信息后，置于-80 ℃备用。

1.5.2 荧光定量PCR法测定病毒滴度

1.5.2.1 RNA的提取 按照TaKaRa病毒核酸纯化试剂盒的操作说明，从PRRSV SH1705病毒液和保存的已知病毒滴度为105TCID50/mL的病毒液中提取RNA，所得RNA于-80 ℃保存备用。

1.5.2.2 反转录 按照TaKaRa逆转录试剂盒的操作说明，反应体系：PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 2 μL，DDW 6 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保温，并将获得的cDNA于-20 ℃保存备用。

1.5.2.3 荧光定量PCR 取标准质粒，依次10倍倍比稀释，配制成10-1～10-9的稀释液，共9个梯度，每个梯度设3个重复，作为模板，按照TaKaRa染料法荧光定量试剂盒说明书的反应体系配制反应液，将反转录得到的cDNA模板以及稀释好的标准品，用PRRSV ORF7特异性引物，在ABI 7300仪器上进行荧光定量PCR反应[20]。反应体系：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，ORF7F(10 μmol/L)0.8 μL，ORF7R(10 μmol/L) 0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，DNA 模板2 μL，DDW 6 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火并延伸31 s，共扩增40个循环。延伸结束收集荧光信号。

1.6 6种中药水提物体外抗PRRSV的效果测定

以荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖水提物的最大安全质量浓度为起始质量浓度，用含2% FBS的DMEM培养液2倍倍比稀释成4个质量浓度梯度，每个质量浓度梯度重复4孔。将PRRSV病毒液稀释为100TCID50，另设利巴韦林阳性对照，病毒对照及细胞对照。于5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养,每天观察细胞病变情况，待病毒对照组细胞病变程度达到80%～90%后，采用MTT法测各孔OD值，计算药物对病毒抑制率[21]：

药物对病毒的抑制率=(加药孔OD490值-病毒对照组OD490值)/(细胞对照孔OD490值-病毒对照孔OD490值)×100%。

1.6.1 阻断作用试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的中药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去药液，加入100TCID50PRRSV病毒液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.6.2 抑制作用试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入100TCID50PRRSV病毒液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的中药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去中药液，加入含2% FBS 的DMEM培养液。

1.6.3 直接灭活试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，同时加入50 μL药液和50 μL病毒液(使药液最高质量浓度为最大安全质量浓度和病毒液终含量为100TCID50)，培养4 h后，弃去药液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.7 数据处理及药效评价

每天用显微镜观察上述各药物组细胞病变情况并记录，根据中药对病毒的抑制率评价其抗病毒的效果，抑制率越高，说明其抗病毒作用越强。应用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 6种中药水提物得率

荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖经提取干燥后粉末质量分别为2.32 g、2.22 g、3.61 g、2.26 g、5.27 g和3.49 g，其得率分别为23.2%、22.2%、36.1%、22.6%、52.7%和34.9%。

2.2 6种中药水提物对细胞的安全质量浓度测定结果

细胞病变观察发现，不同药物对Marc-145细胞都有一定程度的毒性作用，并且药物质量浓度越高毒性作用越强，主要表现为细胞折光性增加，变圆、粘连、破碎，甚至脱落。根据公式以OD490值计算药物对细胞的生长抑制率，当抑制率为0时，则该质量浓度下药物对细胞没有毒性作用，从而确定药物的最大安全质量浓度，结果见表1。荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖水提物的最大安全质量浓度分别为0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、0.16 mg/mL和0.47 mg/mL。

表1 中药水提物对Marc-145细胞的抑制率及安全质量浓度

注：A、B、C、D、E、F分别表示荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖。委陵菜、啤酒花、翻白草和百部的起始质量浓度为5 mg/mL，荆芥和虎杖的起始质量浓度分别为1 mg/mL、15 mg/mL。

Notes: A, B, C, D, E, and F respectively representNepetacatariaL.,PotentillachinensisSer.,HumuluslupulusLinn.,PotentilladiscolorBge.,Stemonajaponica(Blume) Miq. andReynoutriajaponicaHoutt respectively.The initial mass concentrations ofPotentillachinensisSer.,HumuluslupulusLinn.,PotentilladiscolorBge. andStemonajaponica(Blume) Miq. are 5 mg/mL,NepetacatariaL. andReynoutriajaponicaHoutt. are 1 mg/mL and 15 mg/mL, respectively.

2.3 PRRSV的TCID50测定结果

检测结果表明，已知病毒滴度为105TCID50/mL PRRSV病毒液的病毒载量为1.98×108拷贝/mL，扩增后得到的PRRSV病毒液的病毒载量为5.27×108拷贝/mL，经计算，扩增后得到的PRRSV病毒液的病毒滴度为2.66×105TCID50/mL。

2.4 6种中药水提物抗PRRSV的药效

2.4.1 细胞形态观察 各试验组3种作用方式下的细胞形态见图1—3。病毒对照组细胞大部分出现圆缩、团聚、脱落现象，而细胞对照组细胞呈单层生长，形态完好。

2.4.1.1 对PRRSV的阻断作用 从图1可以看出，翻白草药物组细胞病变严重，细胞大量圆缩、团聚，并伴有脱落现象，荆芥和啤酒花药物组出现了轻微细胞病变，细胞出现团聚现象，其他药物组基本无病变，细胞生长正常，有较好的保护作用。

2.4.1.2 对PRRSV的抑制作用 从图2可以看出，啤酒花药物组细胞病变程度严重，细胞圆缩、脱落，荆芥、翻白草和百部药物组出现了细胞团聚现象，有轻微细胞病变，委陵菜和虎杖药物组细胞呈单层生长，形态完好，未出现细胞病变，对细胞保护作用良好。

1：荆芥药物组(0.25 mg/mL)；2:委陵菜药物组(1.25 mg/mL)；3：啤酒花药物组(0.63 mg/mL)；4：翻白草药物组(0.31 mg/mL)；

图2 药物对PRRSV的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of drugs on PRRSV

2.4.1.3 对PRRSV的直接灭活作用 从图3可以看出，委陵菜和虎杖药物组未出现细胞病变，显示出对细胞的保护作用，其他药物组都出现不同程度的细胞病变。

2.4.2 6种中药水提物对细胞的保护作用 MTT法检测中药处理组OD490值，其值越高，说明药物对细胞的保护作用越强，即对PRRSV的抑制作用越强，6种中药水提物抗PRRSV作用的抑制率见表2。从表2可以看出，这6种中药抗PRRSV效果最好的药物质量浓度大部分为最大安全质量浓度，随着质量浓度越来越低，其抑制作用逐渐变弱。

从阻断作用来看，翻白草对PRRSV没有阻断作用，委陵菜、百部和虎杖对PRRSV的阻断作用最强，其对PRRSV的最高抑制率分别为115.8%、120.2%和110.4%，其次是荆芥和啤酒花，其对PRRSV的最高抑制率分别为80.6%和61.5%，也表现出了对细胞良好的保护作用。

图3 药物对PRRSV的直接灭活作用Fig.3 Direct inactivation of drugs on PRRSV

Tab.2 Inhibition rate of PRRSV by different mass concentrations of water extracts of traditional Chinese medicines %

注：C1、C2、C3、C4表示从中药水提物的最大安全质量浓度开始2倍倍比稀释的4个不同质量浓度。

Notes: C1, C2, C3 and C4 represent 4 different mass concentrations diluted from the maximum safe mass concentration of the Chinese herbal medicine water extracts.

从抑制作用看，除啤酒花对细胞几乎没有保护作用外，翻白草对PRRSV的抑制作用最强，其对PRRSV的最高抑制率为129.4%，可以较好地保护细胞，其次是委陵菜和虎杖，其对PRRSV的最高抑制率分别为93.0%和94.3%，对细胞具有很好的保护作用，荆芥和百部对PRRSV的最高抑制率分别为52.2%和61.8%，也可以对细胞起到一定的保护作用。

从直接灭活作用来看，这6种中药水提物对细胞都有不同程度的保护作用，其中委陵菜和虎杖的效果最好,对PRRSV的最高抑制率分别为125.4%和130.8%。

综合3种作用方式的细胞病变情况和抑制率结果，荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6种中药水提物均具有抗病毒活性，对PRRSV具有不同程度的抗病毒作用。其中，委陵菜和虎杖体外抗PRRSV效果最好，其次是荆芥和百部。啤酒花的阻断作用和直接灭活作用明显强于抑制作用，几乎没有抑制作用。翻白草对PRRSV无阻断作用，但其抑制作用和直接灭活作用较强。

3 结论与讨论

中药是天然存在的具有药用价值的一类植物，自从其药用价值被发现以后，就一直被用来治疗各种疾病，且疗效显著[22]。水煎煮法是最早使用的中药提取的传统方法，该方法以水为溶剂，易操作，应用广泛。随着科技的进步，许多新型提取技术得到了越来越广泛的应用，如超临界液体萃取法、超声波提取法、半仿生提取法等，这些提取技术具有提取速度快、效率高、收率好、无污染的特点[23]。但考虑到试验的成本及溶剂的残留可能对细胞造成的毒性作用，本试验采用水煎煮法对荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6种中药进行提取。

体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测生物医用材料或药物等作用于细胞后所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制的方法[24]。该方法具有效率高、成本低等优点。评价中药提取物对细胞是否具有毒性最直观的方法是观察细胞的生长状态。中药提取物对细胞有毒性时，主要表现为细胞折光性增加、变圆、粘连、破碎，甚至脱落[25]。而MTT法也可较为直观地反映细胞活力及状态，其能够用于检测细胞的存活与增殖，可以较为精确地反映活细胞数量。本试验采用MTT法来评价中药提取物对细胞的毒性。这6种中药水提物对细胞的毒性作用各不相同，抑制率为0时，表明该质量浓度下的中药水提物对Marc-145细胞无毒性，得到中药水提物的最大安全质量浓度。荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖对Marc-145细胞的最大安全质量浓度分别为0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、1.56 mg/mL和0.47 mg/mL。冼琼珍等[26]研究了16种中药提取物抗PRRSV的作用，大部分提取物安全质量浓度都在1.56～6.25 mg/mL，本试验中6种中药水提物安全质量浓度的测定结果与其相似，表明本试验所得的中药水提物的安全质量浓度结果真实、可信。

荧光定量PCR是目前检测核酸含量以及分析基因表达水平相对变化的主要技术[27]，其准确性高、特异性强、灵敏度高、操作简便，广泛应用于临床医学和生命科学等多个学科领域[28-29]。本研究采用荧光定量PCR方法检测PRRSV病毒液的病毒载量，根据已知病毒滴度的病毒液，更为快速、准确地得到扩增后PRRSV病毒液的病毒滴度。

体外细胞培养法是进行药物抗病毒体外筛选的主要方法，即在细胞感染病毒后，检测药物对病毒的抑制作用。常用的检测方法有染料摄入法、MTT法、空斑法、细胞病变效应法等[30]。本试验结合MTT法和细胞病变观察法，评价中药提取物抗PRRSV的作用效果。大部分细胞在感染病毒后，细胞发生圆缩、团聚、脱落，甚至损伤、死亡等现象，可在显微镜下观察，这些细胞特性的改变称之为细胞病变效应，该法有助于对抗病毒药物的初步鉴定。同时结合MTT法，可较为准确地找出抗病毒效果强的中药提取物。

综合3种作用方式，荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖这6种中药对PRRSV都有不同程度的抗病毒作用，其中委陵菜和虎杖对PRRSV的抗病毒效果显著，这2种中药的3种作用方式最高抑制率都达到90%以上，且细胞未出现明显病变，说明无论是对病毒的阻断、抑制，还是杀灭作用，这2种药物均具有很好的疗效，能够较好地起到保护细胞的作用。百部和荆芥对PRRSV的抗病毒作用也较强。啤酒花对PRRSV不能起到很好的抑制作用，翻白草对PRRSV的阻断作用较弱，但这2种药物的其他2种作用方式都能够对细胞起到良好的保护作用，说明其具有一定的抗病毒活性。从中药提取物对PRRSV的抑制率看，部分中药提取物对病毒的最大抑制率达到了100%以上，表明在此质量浓度下的中药提取物对细胞是无毒的，也说明一定质量浓度的中药提取物能促进细胞的生长，这与胡元亮等[31]、布玮玮[32]测定结果相符，可能与中药自身所含的多糖类、生物碱类、黄酮类或挥发油类以及生长调节因子促进细胞生长密切相关。

本研究结果显示，荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖这6种中药均具有体外抗PRRSV病毒活性，其中委陵菜和虎杖体外抗PRRSV的作用最佳，其次是荆芥和百部，啤酒花和翻白草也具有一定的抗PRRSV作用，可以用于PRRSV的临床治疗，但这6种中药的抗病毒机制还有待进一步研究。