清热解毒法对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤转移的影响*

周华妙 郭 勇

浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

乳腺癌是严重威胁全球女性健康的疾病之一，我国女性乳腺癌发病人数约24.9万,发病率37.86/10万，在近10年发病呈上升趋势[1]，但乳腺癌的总体生存状况明显好于其他常见恶性肿瘤，我国女性乳腺癌患者的5年生存率估计为73%，条件较好的大城市可达80%，而影响其死亡的仍然是复发转移。乳腺癌在中医学中多属于“乳岩”“乳石痈”，由于情志失调，肝气郁结或因冲任失调，气血运行不畅，气滞血瘀，热毒结滞于乳中而发病。而清热解毒法是中医治疗肿瘤的常用治法之一，并在长期的临床治疗中获得了一定的疗效[2]，但是其作用机制报道不多。本次实验中建立乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠模型，选用黄连解毒汤进行干预，观察其对乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠肿瘤细胞侵袭迁移能力，探寻对肿瘤相关巨噬细胞的影响及一些可能的相关机理。

1 材料与方法

1.1 动物：8周龄Balb/c小鼠，体重为18±2g，SPF级饲养；浙江中医药大学动物实验中心喂养（实验动物编号：0238458；0238459）。

1.2 细胞株：小鼠乳腺癌4T1细胞株由浙江中医药大学动物实验中心细胞房提供。

1.3 主要试剂与仪器：黄连解毒汤由浙江省中医院中药房熬制并于浙江中医药大学制剂中心浓煎后灭菌封装备用。灌胃工具由浙江中医药大学动物实验中心提供。基质胶（BD-P 253234），Transwe11小室（Corning），PBS（1×）（凯基），DMEM高糖培养基（1×）（吉诺），1640培养基（1×）（含双抗）（凯基），胎牛血清（四季青），0.25%胰酶-EDTA（吉诺），BSA(MULTICELL)，结晶紫（达文），移液枪（eppendorf），离心机（Thermo），荧光倒置显微镜（Zeiss），高压灭菌箱（SANYO）等。

1.4 试验方法与步骤：将20只8周龄雌性Balb/c小鼠按随机数字表法随机分为2组，每组10只，即单纯荷瘤组、清热解毒组。于单纯荷瘤组、清热解毒组小鼠乳腺脂肪垫接种小鼠乳腺癌4T1细胞，接种后24h给药：单纯荷瘤组：以饮用水灌胃，每日0.2ml/10g；清热解毒组：以黄连解毒汤灌胃，每日0.2ml/10g。持续用药35天，黄连解毒汤组成：黄芩、栀子各9g，黄连、黄柏各6g。汤剂由浙江省中医院中药房熬制并于浙江中医药大学制剂中心浓煎后灭菌封装备用。

1.5 瘤体及其他组织标本：第35天于超净台解剖各组小鼠，以无菌眼科剪、手术刀片打开小鼠胸腔、腹腔并开颅，行大体观察，剥离出瘤体，做记录，称重，拍照。对瘤体处理：①进行Tanswell侵袭及迁移实验；②进行流式细胞分析；③取出小鼠右侧肺脏于电子天平中称重，脱水、包埋，常规石蜡切片，进行HE染色计数右肺转移结节灶。

1.6 Transwell侵袭实验：①Transwell小室制备：用50mg/L基质胶1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。②制备细胞悬液：小鼠乳腺原位接种后24d，行颈椎脱臼法处死，选择单纯荷瘤组、清热解毒组乳腺原位瘤体组织，取出后采用组织块接种法移植回培养瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培养基行体外培养，3天后移去小瘤块，换液后继续培养以扩大细胞总量。将瓶中处于对数生长期的细胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，调整细胞密度至1×105～5×105。③接种培养细胞：细胞悬液（100～200μl）加入Transwell小室，常规培养24小时。④结果统计：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，采用0.1%结晶紫进行细胞染色，显微镜进行观察和拍照，取10个视野计数细胞个数。

1.7 Transwell迁移实验：①Transwell小室每孔加入50μl含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。②制备细胞悬液：小鼠乳腺原位接种后24d，行颈椎脱臼法处死，选择单纯荷瘤组、清热解毒组乳腺原位瘤体组织，取出后采用组织块接种法移植回培养瓶中，予含10%胎牛血清的DMEM完全培养基行体外培养，3天后移去小瘤块，换液后继续培养以扩大细胞总量。将瓶中处于对数生长期的细胞（密度70%～80%）用0.25%胰酶-EDTA消化，调整细胞密度至1×105～5×105。③接种培养细胞：细胞悬液（100～200μl）加入Transwell小室，常规培养24小时。④用棉签擦去上室内的细胞，采用0.1%结晶紫进行细胞染色，显微镜进行观察和拍照，取10个视野统计细胞迁移面积，并计算迁移面积百分比。取平均数作为迁移面积百分比结果，进行整理及统计分析。

1.8 流式细胞分析术：将新鲜肿瘤提取巨噬细胞，上机检测，使用BD FACSCantoⅡ进行流式细胞计数分析，根据抗体与检测通道“强弱搭配”原则，抗体F4/80使用FITC通道，CD206使用APC通道，iNOS使用PE通道，先用单抗体染色样本选定阳性区域，以FITC、PE通道双阳性表示M1型巨噬细胞，以FITC、APC通道双阳性表示M2型巨噬细胞进行细胞计数，分别计算其在样本细胞中的阳性率，并将阳性率结果进行整理及统计分析。

1.9 统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件分析处理。统计描述：计量资料数据用均数±标准差(-x±s)表示。统计推断：两组间均数的比较用t检验分析，均以P＜0.05为差异显著的检验标准。

2 结果

2.1 HE染色观察肺脏转移情况：见图1。两组小鼠肺组织表面凹凸不平，可见散在透亮的类圆形结节灶。肺组织HE染色，各组小鼠肺组织中均可见明显的团状肿瘤细胞生长，伴有大量异形核细胞增生，大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。低倍镜（100×）下观察并随机取4个视野计数小鼠右肺转移灶。结果显示，单纯荷瘤组3.5±1.29个小鼠肺部转移灶，清热解毒组2.7±0.96个，与单纯荷瘤组相比较少，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 小鼠肺部转移灶HE染色

2.2 Transwell侵袭及迁移实验观察肿瘤细胞转移能力：见图2、图3。侵袭实验结果：清热解毒组穿透Transwell膜的细胞数量268.4±11.23，比单纯荷瘤组（285.7±13.55）有所减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；迁移实验结果：清热解毒组迁移面积百分比（66.76±7.46）%与单纯荷瘤组（72.3±2.83）%相比有所减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 Transwell侵袭实验

图3 Transwell迁移实验

2.3 流式细胞术检测小鼠肿瘤相关巨噬细胞：见图4。抗体F4/80使用FITC通道，iNOS使用PE通道，CD206使用APC通道，以F4/80(+)iNOS(+)代表M1型巨噬细胞，F4/80(+)CD206(+)代表M2型巨噬细胞。结果如下：M1型巨噬细胞：单纯荷瘤组中M1型巨噬细胞含量较低（1.8±0.10）%，清热解毒组中M1型巨噬细胞含量（2.3±0.20）%与单纯荷瘤组相比较多，差异有统计学意义（P＜0.05）；M2型巨噬细胞：清热解毒组中M2型巨噬细胞含量较高（36.3±3.70）%，与单纯荷瘤组（21.5±1.50）%相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图4 流式细胞分析

3 讨论

肿瘤转移是一系列复杂的、多步骤、多因素相互作用的连续过程，由原发瘤发展成为侵袭性肿瘤，肿瘤细胞侵袭基底膜，并进入淋巴系统与血液循环，形成瘤栓，进入并穿出靶器官微血管，形成转移灶[3]。本实验采用经典的黄连解毒汤干预荷瘤小鼠，该方具有抗菌、抗内毒素、解热镇痛、抗肿瘤作用等诸多药理作用[4]，可明显抑制肿瘤细胞的增殖能力以及诱导肿瘤细胞凋亡[5]。其有效成分汉黄芩素可明显抑制肿瘤细胞分裂和集落形成能力，从而抑制其增殖，同时，可通过启动线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡[6]。在肿瘤组织中，TAMs通常被定向极化为具有免疫抑制作用的M2型巨噬细胞，直接抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞）和自然杀伤细胞（NK细胞）对肿瘤的杀伤作用[7-10]。研究发现[11]，荷瘤小鼠经黄连解毒汤干预后，肿瘤组织新生微血管数目减少，故其控制肿瘤细胞转移的作用可能与抗肿瘤血管生成有关。

中医学认为，肿瘤其证多属本虚标实，而“女子乳头属肝，乳房属胃”，若肝失疏泄，气机郁滞，或脾胃运化失司，湿热蕴结，则易乳络闭阻，气血热毒瘀滞，发生病变。黄连解毒汤以清热解毒为法，清解蕴结之热毒，化邪去毒，是治疗乳腺癌的主要治法之一。本实验中观察到黄连解毒汤干预后，荷瘤小鼠肿瘤细胞的侵袭迁移能力产生了一定的抑制，笔者推测通过清热解毒减弱了肿瘤细胞的侵袭迁移，另外，荷瘤小鼠的肺转移灶有减少趋势，而流式细胞检测发现肿瘤相关巨噬细胞M1型、M2型均有增加，故推测黄连解毒汤一定程度抑制肿瘤侵袭迁移，从而达到控制肿瘤的远处转移，可能并非主要通过调节肿瘤相关巨噬细胞中M1以改善免疫微环境来抑制肿瘤发展，这与中医理论中清热解毒以祛邪为主相统一。但因考虑到小鼠辨证论治的困难度，因此在实验中未进行辨证论治，存在一定的局限性，以及进一步的可能机制有待继续探讨和研究。