红花绿绒蒿中总黄酮的含量测定及提取工艺优化

刘明珠，李 清，暨迪军，卢永昌,4

（1. 青海民族大学 药学院，青海 西宁 810007；2. 青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；3. 青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007；4. 青海省现代藏药创制工程技术研究中心，青海 西宁 810007）

红花绿绒蒿（Meconopsis punicea Maxim）是一种传统的藏药材，藏药名为“吾白玛布”，为罂粟科绿绒蒿属植物，多年生草本，主要分布于我国青海、西藏、四川、甘肃等地海拔3 400 m的高山草甸、林间。红花绿绒蒿味甘、涩，性寒，可清热，多用于治疗血热、肺热、肝热等热症。此外，现代药理学表明，绿绒蒿属植物具有抗疲劳、止泻镇静、镇痛、保肝等作用。

红花绿绒蒿含有黄酮类如木犀草素、槲皮素、山奈酚及其苷等化学组分。黄酮类化合物是植物次生代谢产物，存在于多种植物中，不仅结构类型复杂多样，而且数量种类繁多。此类化合物因其独特的化学结构，对不同种类细胞、哺乳动物等具有重要的生理、生化作用，是许多中草药的有效成分。黄酮类化合物能降低肿瘤、癌症、心血管疾病（例如对心脑血管系统有益的芦丁、橙皮苷等能够降低血管脆性及异常通透性，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂）、脂质过氧化以及骨质疏松等疾病的发病率。

目前，国内外对红花绿绒蒿化学成分的研究较少。因此，本研究采用正交试验设计优化红花绿绒蒿中总黄酮的提取条件，并采用紫外分光光度法测定红花绿绒蒿中总黄酮的含量，以期为红花绿绒蒿药材的质量评价提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

722E型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-6，金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子分析天平；回流提取装置。

芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号1811260038）；其他试剂均为分析纯。

红花绿绒蒿于2019年7月采自青海省果洛州大武镇，经青海民族大学卢永昌教授鉴定确认后，取干燥红花绿绒蒿全草进行粉碎后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的制备准确称量芦丁对照品9.6 mg于50 mL容量瓶中，加60%乙醇20 mL，超声处理使之完全溶解，以60%乙醇稀释定容，得到质量浓度为0.192 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备准确称取红花绿绒蒿1.0 g并置于圆底烧瓶中，加入60%乙醇25 mL，称定质量，回流提取1.5 h，冷却，再次称质量，以60%乙醇补足缺失的质量，过滤，取续滤液，做为供试品溶液备用。

1.2.3 标准曲线的绘制准确吸取1.2.1中制备的芦丁对照品溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL分别置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇稀释定容。准确量取不同含量对照品溶液2.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠溶液1.00 mL摇匀，静置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀后静置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠溶液10.00 mL摇匀，加60%乙醇稀释定容，摇匀后静置15 min，以60%乙醇加相应试剂作为空白，于510 nm处测定吸光度。以芦丁对照品溶液作为横坐标，吸光度值作为纵坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程为Y=0.013 2X+0.028 1（r=0.999 6），线性范围：0.028 4～0.030 1 mg/mL。

1.2.4 提取方法对红花绿绒蒿中总黄酮含量的影响分别准确称取5份1.0 g红花绿绒蒿，各加入60%乙醇40 mL，分别采用超声法、热回流法、浸提法、煎煮法、索氏提取法提取1 h，过滤后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算总黄酮含量。

1.2.5 提取时间对红花绿绒蒿中总黄酮含量的影响分别准确称取5份1.0 g红花绿绒蒿并置于圆底烧瓶中，以60%乙醇作为溶剂，准确移加40 mL，分别使用热回流法提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，过滤后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算总黄酮含量。

1.2.6 料液比对总黄酮含量的影响分别准确称取5份1.0 g红花绿绒蒿并置于圆底烧瓶中，以60%乙醇作为溶剂，热回流法提取1.5 h，设置料液比分别为1∶10、1∶ 20、1∶30、1∶ 40、1∶ 50，过滤后按 1.2.3中的方法，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算总黄酮含量。

1.2.7 乙醇浓度对红花绿绒蒿中总黄酮含量的影响

分别准确称取5份1.0 g红花绿绒蒿并置于圆底烧瓶中，加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇各40 mL，热回流法提取1.5 h，过滤后按1.2.3中的方法，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算总黄酮含量。

1.3 正交试验与验证试验

以总黄酮含量为评价指标，通过提取方法、提取时间、料液比、乙醇含量进行单因素考察，筛选对红花绿绒蒿中总黄酮提取影响较大的因素进行正交试验，然后按照所得最优的提取方案进行验证试验。

1.4 数据处理

试验数据均采用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

如图1所示，红花绿绒蒿中总黄酮含量用热回流法提取效果最好，其次是煎煮法，超声法和索氏提取法效果相似，浸提法的效果最差。可能是由于热回流法阻止了高温所造成的溶剂挥发，使总黄酮更好的溶解于提取剂当中。

图1 不同提取方法对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

2.2 不同提取时间对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

如图2所示，随着提取时间延长，总黄酮含量也随之增大。但当提取时间延长至1.5 h后，总黄酮含量呈下降趋势。因此，提取总黄酮的最佳时间为1.5 h。

图2 不同提取时间对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

2.3 不同料液比对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

如图3所示，红花绿绒蒿中总黄酮含量随料液比的增加而增大，当料液比达到1∶40时，红花绿绒蒿中总黄酮含量已经很高。随着料液比的进一步增大，红花绿绒蒿中总黄酮的含量仅略微上升。综合考虑后，确定最佳料液比为1∶40。

图3 不同料液比对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

2.4 不同乙醇含量对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

如图4所示，随着乙醇含量的升高，提取的红花绿绒蒿总黄酮含量呈先上升后下降的趋势。当乙醇含量为60%时，得到的总黄酮含量最高。

图4 不同乙醇含量对红花绿绒蒿中总黄酮提取的影响

2.5 正交试验

如表1所示，进行单因素考察发现，提取时间、料液比、乙醇含量对提取效果影响最大，对总黄酮含量影响的主次因素依次为料液比＞提取时间＞乙醇含量，从而选择提取时间、料液比、乙醇含量进行正交试验设计。由表2可知，红花绿绒蒿中总黄酮提取的最佳条件组合为A2B2C3，即提取时间为1.5 h，乙醇含量为60%，料液比为1∶40，此时所得总黄酮含量为1.06 mg/g。

表1 L9（33）因素分析

表2 正交试验设计与分析

2.6 红花绿绒蒿中总黄酮最优提取方法的验证实验

由表3可知，以提取时间为1.5 h，乙醇含量为60%，料液比为1∶40的条件，对红花绿绒蒿总黄酮进行提取，所得总黄酮含量稳定在1.03～1.12 mg/g，说明上述条件下提取效果较好。

表3 红花绿绒蒿中总黄酮提取方法的验证试验分析

3 结论与讨论

通过单因素考察及正交试验结果可知，影响总黄酮含量的主次因素大小依次为料液比＞提取时间＞乙醇含量，最佳提取工艺条件为A2B2C3，即提取时间为1.5 h、乙醇含量为60%、料液比为1∶40，此时所得总黄酮含量为1.06 mg/g，通过验证试验也进一步表明所选提取条件为最优工艺。相比于其他研究中对全缘叶绿绒蒿和五脉绿绒蒿中的总黄酮含量测定，本试验提取的红花绿绒蒿中总黄酮含量更高。

因此，本试验采用正交试验法与紫外可见分光光度法，对红花绿绒蒿总黄酮的提取工艺进行了优化，所得总黄酮含量提高。因此，本试验建立的红花绿绒蒿中总黄酮含量的提取方法简便易行、重现性较好，可作为红花绿绒蒿药材的质量评价依据，具有一定的参考价值。