高效液相色谱法测定人纤维蛋白条件的探索

于涛 孙丽丽

摘 要：本文探索了高效液相色谱法检测人纤维蛋白含量的色谱条件，在固定波长下，配置不同比例的磷酸盐缓冲液流动相对检测结果进行比对，选出最适合的流动相配比;选定最佳组合条件并为开展进一步分析提供理论依据。

关键词：高效液相色谱法;人纤维蛋白

Exploration of determination of human fibrin conditions

by high performance liquid chromatography

Yu Tao*SunLiLi

Changchun Medical College JiLinChangchun 130031

Abstract：In this paper，the chromatographic conditions for the determination of human fibrin content by high performance liquid chromatography were explored.The relative detection results of different ratios of phosphate buffer flow were compared at a fixed wavelength to select the most suitable mobile phase ratio.The combination conditions provide a theoretical basis for further analysis.

Key words：High performance liquid chromatography;human fibrin

人纤维蛋白原（简称纤原），是血浆蛋白的主要成分，也是凝血系统中的“中心”蛋白质，具有止血功能，除直接参与凝血过程后期阶段，还介导血小板聚集、影响血液黏度。

《中国药典》表明蛋白含量测定可分柱前衍生和柱后衍生两大类，人纤维蛋白含量测定属于柱前衍生法，衍生试剂具有毒性，且分析时间长（超过30min），本实验采用Shodex KW-800系列凝胶色谱柱KW-802.5进行分析，设定几组不同条件的流动相配比进行测定，筛选出最佳的实验条件，建立一种低成本高效率测定方法。

1 材料与方法

1.1 样品准备

人纤维蛋白原为BIOSHARP公司产品，规格：100mg/支，Exp：2017/03。

1.2 主要试剂及仪器

磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，乙腈（分析纯），凝胶色谱柱Shodex KW-802.5，岛津紫外检测器。

1.3 流动相及样品溶液的制备

流动相采用乙腈-纯水（1：1）、乙腈-磷酸盐缓冲溶液（分别配置比例4∶6、1∶1、6∶4），称取磷酸二氢钠9.5g，磷酸氢二钠125g，至于500mL容量瓶中，超纯水溶解并定容，另取500mL乙腈与其混合，用0.45μm有机膜过滤。

1.4 样品处理

精密量取样品溶液1mL，加入相对应的流动相乙腈-磷酸盐缓冲液和乙腈-纯水溶液99mL，充分混匀，静止30min，进行蛋白质沉淀，离心5min，取上层清液进行测定。

1.5 色谱条件

采用凝胶色譜柱Shodex KW-802.5（5μm，8*300 mm）;流速1mL/min;波长设定为205nm、215nm、230nm、280nm;柱温40℃;采用岛津LC-15C色谱工作站;进样量20μL。

1.6 实验方法

紫外吸收波长不变，分别在不同配比的流动相条件下分析蛋白分子保留时间及色谱峰强度，筛选最适合的实验条件。

2 实验结果

不同流动相配比下检测结果（紫外吸收波长设定为215nm）。（1）流动相配比为乙腈：水=1∶1，结果见图1。

通过谱图可看出，没有磷酸盐缓冲液保护，蛋白分子结构稳定性差，色谱峰保留时间和对称性也都不理想，达不到进一步实验的目的，并且此种情况与乙腈-纯水的比例无关，蛋白质氨基酸高效液相分析中不适合采用此种流动相配置。

（2）以乙腈-磷酸盐缓冲液做流动相，配比分别为4∶6、1∶1、6∶4，检测结果见图2、图3、图4。

通过图谱可看出，在乙腈比例低于磷酸盐缓冲液时色谱峰保留时间推迟较大，色谱峰与其它两种流动相检测结果相比差别较大，初步判断为水相比例过高，出现色谱峰形拖尾严重，并出现色谱峰消失现象;在乙腈高于磷酸盐缓冲液的流动相检测结果得出：虽然峰形和对称性较好，但是蛋白检测比例整体降低，乙腈含量的增加没有增强蛋白分子的洗脱效果，保留时间变化不大。

3 讨论

本实验通过对流动相配比条件的摸索，确定在215nm波长下，乙腈-磷酸盐缓冲液比例在1∶1配比下有最佳实验效果，当增加乙腈比例为7∶3时，溶液出现分层现象，无法做流动相使用。若降低磷酸盐含量，则出现蛋白洗脱含量降低，色谱峰对称性及分离度降低的情况，综合其它测试结果考虑建议保持磷酸盐含量不变。通过此次实验方法条件的摸索，得到最佳实验条件，测定结果稳定，有良好的重复性，可直接用于人纤维蛋白含量测定，无需使用含有毒性的衍生剂，且该方法节约了检测时间、试剂成本，提高了效率，可用于进一步实验研究。

参考文献：

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