单因素试验结合Box—Behnken设计—响应面法优化甘草中黄酮类成分的提取工艺

袁思文 刘育辰 刘刚 郝杰 金文渊

中图分类号 R927.2；R932 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）03-0355-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.15

摘 要 目的：优化甘草中黄酮类成分的提取工艺。方法：以芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷4种黄酮类成分的总提取量为考察指标，以提取溶剂种类（水、乙醇）及其不同体积分数、加入量与提取时间为考察因素，在单因素试验基础上，运用Box-Behnken设计-响应面法优化甘草中黄酮类成分的提取工艺，并进行验证试验。结果：优化的提取工艺为以50%乙醇为提取溶剂，在0.200 g药材中加入50 mL，超声提取50 min。在驗证试验中，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷提取量分别为10.733 0、27.784 9、3.441 9、0.429 1 mg/g（RSD均<3.0%，n=3），4种黄酮类成分平均总提取量为42.388 9 mg/g，与预测值（42.173 2 mg/g）的相对误差为0.52%（n=3）。结论：优化的提取工艺简便、快捷、稳定，可用于甘草中黄酮类成分的提取。

关键词 甘草；黄酮类成分；芹糖甘草苷；甘草苷；芹糖异甘草苷；芒柄花苷；Box-Behnken设计-响应面法；提取工艺；优化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology of the flavonoids from Glycyrrhiza uralensis. METHODS： Using total contents of four flavonoids， liquiritinapioside， glycyrrhizin， isoliquiritin apioside and formononetin as indexes， types and volume fractions of extraction solvents （water， ethanol）， volume of addition and extraction time as factors， based on single factor experiment， Box-Behnken design-response surface method was used to optimize the extraction technology of flavonoids from G. uralensis. Validation test was also conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was 50 mL 50% ethanol as extraction solvent， 0.200 g G. uralensis， ultrasonic extraction for 50 min. In validation test， the extraction amounts of liquiritinapioside， glycyrrhizin， isoliquiritin apioside and formononetin were 10.733 0， 27.784 9， 3.441 9， 0.429 1 mg/g， respectively （all RSDs<3.0%， n=3）. The average total extraction amount of four flavonoids was obtained was 42.388 9 mg/g， the relative error of which to predicted value （42.173 2 mg/g） was 0.52% （n=3）. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology is simple， rapid and stable， and can be used for the extraction of flavonoids from G. uralensis.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis； Flavonoids； Liquiritinapioside； Glycyrrhizin； Isoliquiritin apioside； Formononetin； Box- Behnken design-response surface methodology； Extraction technology； Optimization

甘草为豆科甘草属植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiz glabral L.）的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[1]。以其制成的制剂在临床上主要用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹及四肢挛急疼痛、痈肿疮毒，还可缓解其他药物的毒性、烈性[2]。现代药理研究表明，甘草具有镇咳、抗病毒、抗肿瘤活性以及肝保护作用[3]。甘草中含有黄酮类、皂苷类、香豆素类、二苯乙烯类以及糖类成分[4]，其中甘草总黄酮具有抗炎、抗病毒、抗氧化、强心、镇静和镇痛作用，并对人类免疫缺陷病毒有较强的抑制增殖作用[5]。黄酮类化合物是甘草中已知的主要活性物质，其中甘草苷的抗抑郁作用显著[6]，芹糖异甘草苷有显著的镇咳效果[7]，而且以芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷等为代表，可以用于不同基源甘草的鉴别研究[8]。响应面法（Response surface methodology，RSM）是一种常用于优化提取工艺条件的方法[9]，具有试验次数少、精度高、预测值精准的优点[10]，已广泛应用于百花蛇舌草[9]、枳壳[11]、酸藤子[12]、桑叶总黄酮[13]、仙鹤草[14]、山茱萸[15]等中药提取工艺的研究。本试验选择芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷作为黄酮类成分的代表，以这4种成分的总提取量作为考察指标，采用Box-Behnken设计-响应面法优化甘草中黄酮类成分的提取工艺，为甘草中黄酮类成分的进一步开发、利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

SB-5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；EX225DZH十万分之一天平[美国奥豪斯仪器（上海）有限公司）]；LC-2030CN高效液相色谱仪，包括紫外检测器（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

甘草药材于2016年10月采自兰州市榆中县，经贵阳中医学院刘育辰副教授鉴定为甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根茎；芹糖甘草苷（宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：20170710，纯度：98%）；甘草苷（批号：CHB160307，纯度：98%）、芹糖異甘草苷（批号：AB17060712，纯度：98%）对照品均购于成都埃法生物科技有限公司；芒柄花苷对照品（贵州迪大生物科技有限责任公司，批号：GZDD-0721，纯度：99.62%）；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 4种成分的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 本课题组前期研究建立的色谱条件[8]如下：色谱柱为CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，18%→21%A；12～21 min，21%→23%A；21～30 min，23%→25%A；30～40 min，25%→30%A；40～50 min，30%→35%A；50～55 min，35%→40%A；55～56 min，40%→100%A；56～70 min，100%A）；检测波长为265 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；对照品进样体积为10 μL，供试品进样体积为20 μL。

取“2.1.2”项下供试品溶液和混合对照品溶液进样分析，结果，理论板数按芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷峰计均大于9 000；保留时间分别为12.09、13.19、26.79、28.69 min，表明各成分在此条件下基线分离良好。色谱图见图1。

2.1.2 溶液的制备 （1）混合对照品溶液。分别精密称取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷对照品适量，加50%乙醇溶解，配制成质量浓度分别为0.080 4、0.052 5、0.032 0、0.004 3 mg/mL的混合对照品溶液。（2）供试品溶液。精密称取甘草粉末0.200 g，置于具塞锥形瓶中，加入提取溶剂50%乙醇50 mL，超声提取（功率：200 W，频率：40 kHz）50 min。放置至室温后称质量并用50%乙醇补足质量，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 线性关系考察 取“2.1.2”项下的混合对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各对照品进样量（μg）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。将上述混合对照品溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比（S/N）约为10倍时的进样量确定为定量限。线性关系及定量限结果见表1。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷峰面积的RSD分别为0.04%、0.05%、0.11%、0.18%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷含量的平均值分别为9.135 5、30.829 0、2.442 8、0.358 9 mg/g，RSD分别为0.73%、1.15%、1.57%、1.60%（n=6），表明重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液6份，分别于室温下放置0、3、5、8、13、20、24 h后进样测定。结果表明，供试品溶液中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷峰面积的RSD分别为0.91%、0.62%、0.51%、1.43%（n=7），表明供试品溶液中4种成分的含量在室温下放置24 h内稳定。

2.1.7 加样回收率试验 取已知含量的药材样品6份，每份约0.100 g，分别加入芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷对照品溶液各适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率和RSD值。结果，4种成分的平均回收率为97.77%～102.08%，RSD为0.46%～1.87%（n=6），详见表2。

2.2 单因素试验考察

2.2.1 提取溶剂 称取0.200 g甘草粉末2份，分别以50 mL 70%乙醇、水溶液为提取溶剂进行超声提取（功率：200 W ，频率：40 kHz，下同）30 min，同时做平行试验一次。以4种黄酮类成分总提取量为指标，结果以70%乙醇为提取溶剂时较高，经综合考虑，选择乙醇为提取溶剂，详见表3。

2.2.2 提取溶剂的体积分数 称取0.200 g甘草药材粉末2份，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50 mL，超声提取30 min，同时做平行试验一次，测定各成分提取量。结果以乙醇体积分数为50%时，4种黄酮类成分的总提取量最大，详见表4。

2.2.3 提取溶剂加入量 称取0.200 g甘草药材粉末2份，分别加入30、40、50、60、70 mL的50%乙醇溶液，超声提取30 min，同时做平行试验一次。测定4种黄酮类成分的提取量。结果以加入40 mL 50%乙醇溶液进行提取时，4种黄酮类成分的总提取量最大，详见表5。