UPLC—Q—TOF—MS法分析防风中香豆素类化学成分

任晓蕾 霍金海 孙国东 魏文峰 王伟明

中图分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）03-0349-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.14

摘 要 目的：分析防风中香豆素类化学成分，为全面解析防风药材的药效物质基础提供参考。方法：采用超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）法。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（梯度洗脱），流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为3 ?L；质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI）在正、负离子模式下进行检测，离子喷雾电压ESI+/ESI-为5 500 V/-4 500 V，去簇电压为80～-80 V，辅助加热气压力为55.00 psi，雾化气压力为-55 psi，气帘气压力为-35.00 psi，去溶剂温度为550 ℃，碰撞活化扫描能量为15 eV；碰撞电压为35 psi。通过与相关文献数据及标准品图谱对照，并结合UPLC-Q-TOF-MS提供的化合物准确相对分子质量进行成分分析及鉴定。结果：在ESI+模式下共解析出了135个化学成分，在ESI-模式下共解析出了105个化学成分。并鉴定出了在ESI+模式下的异欧芹素乙、伞形花内酯、东莨菪素、花椒毒素、补骨脂素、Ostenol、秦皮啶、异欧前胡素、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素、珊瑚菜素、紫花前胡素等11个香豆素类化学成分。结论：该方法准确、快速，可用于防风中香豆素类化学成分的分析。

关键词 防风；化学成分；超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱仪；香豆素

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze chemical components as coumarin in Saposhnikovia divaricata， and to provide reference for comprehensive analysis of pharmacodynamic material base in S. divaricata. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS method was adopted. Chromatographic condition： the determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid water-0.1% formic acid acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and sample size was 3 ?L. MS condition： ESI， in positive and negative ion mode， ESI+/ESI- 5 500 V/-4 500 V， declustering potential of 80--80 V， auxiliary heating gas pressure of 55.00 psi， atomizing gas pressure of -55 psi， curtain gas pressure of -35.00 psi， desolvent temperature of 550 ℃， collision activation scanning energy of 15 eV， collision voltage of 35 psi. Component analysis was performed by comparing with the related literature data and the standard chromatogram control combined with accurate relative molecular mass of compounds provided by UPLC-Q-TOF-MS. RESULTS： Totally 135 chemical components were analyzed in ESI+ mode， and the 105 chemical components were analyzed in ESI- mode. 11 chemical components as coumarin were identified in ESI+ mode， such as isoimperatorin， umbelliferone， scopolamine， xanthotoxin， psoralen， Ostenol， fraxidin， isoimperatorin， 5-hydroxyl-8-methoxypsoralen， phellopterin， decursin. CONCLUSIONS： The method is accurate and rapid， and can be used for the analysis of chemical components as coumarin in S. divaricata.

KEYWORDS Saposhnikovia divaricata； Chemical components； UPLC-Q-TOF-MS； Coumarin

防風为伞形科植物防风[Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.]未抽花茎植株的干燥根[1]，始载于《神农本草经》，列为上品[2]，现主产于黑龙江、内蒙古、辽宁、吉林、河北等省区，其中以黑龙江杜尔伯特（泰康）为中心的草原地区所产的“小蒿子防风”品质最为优良[3]。现代研究表明，防风药材主要含有色原酮、挥发油、香豆素、多糖及有机酸等多种化学成分，具有抗炎、解热、镇痛、抗凝血及抗肿瘤等活性[4-7]。目前，针对防风的化学成分研究多见于早年的植化分离[8-10]，质量评定多见于2015年版《中国药典》（一部）防风项下2种色原酮成分的含量测定[1，11-14]，不但检测手段单一，且所建立方法不能全面反映防风药材的成分。随着对其药理作用的深入开展，防风化学成分的快速全面鉴定成为亟待解决的问题。本课题组前期已采用超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）法对防风中最主要的化学成分——色原酮类成分进行了详细解析[6]。香豆素类成分为其另一生物活性主要相关联的有效成分，具有镇痛、镇静、抗肿瘤等药理作用[7]，故本研究继续采用UPLC-Q-TOF-MS法对防风药材中次主要成分——香豆素类成分进行鉴定，以便进一步阐明防风的药效物质基础。

2.4.4 花椒毒素 峰4的tR为5.4 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=217[M+H]+，脱去一分子甲基形成特征碎片m/z=202[M+H-CH3]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=174[M+H-CO-CH3]+；准分子离子峰分别脱去一分子、两分子CO形成特征碎片m/z=189[M+H-CO]+、m/z=161[M+H-2CO]+，再脱去一分子甲基形成特征碎片m/z=146[M+H-2CO-CH3]+。根据元素组成分析，该化合物的分子式为C12H8O4，相对分子质量理论值为217.048 9、实测值为217.049 54，误差为2.95 ppm。据文献报道[16]，防风中含有花椒毒素，其相对分子质量为217，因此判断该化合物为花椒毒素，峰4的MS/MS图见图5。

2.4.5 补骨脂素 峰5的tR为8.5 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=187[M+H]+，脱去一分子CO2形成特征碎片m/z=143[M+H-CO2]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=115[M+H-CO2-CO]+；准分子离子峰分别脱去一分子、两分子、三分子CO形成特征碎片m/z=159[M+H-CO]+、m/z=131[M+H-2CO]+、m/z=103[M+H-3CO]+，再脱去一分子C2H2形成碎片离子m/z=77[M+H-3CO- C2H2]+。根据元素组成分析和相关文献报道[7]，推断该化合物分子式为C11H6O3，相对分子质量理论值为187.038 05、实测值为187.038 97，误差为4.92 ppm。且峰5的裂解规律与补骨脂素对照品相似，可以确定该化合物为补骨脂素，峰5和补骨脂素对照品的MS/MS图见图6。

2.4.6 Ostenol 峰6的tR为10.2 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=231[M+H]+，脱去一分子C3H6形成特征碎片m/z=189[M+H-C3H6]+；准分子离子峰脱去一分子C4H8形成特征碎片m/z=175[M+H-C4H8]+，再分别脱去一分子、两分子、三分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C4H8-CO]+、m/z=119[M+H-C4H8-2CO]+、m/z=91[M+H-C4H8-3CO]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C14H14O3；相对分子质量理论值为231.101 21、实测值为231.101 57，误差为1.56 ppm。据文献报道[13]，防风中含有Ostenol，其相对分子质量为231，因此判断该化合物可能为Ostenol，峰6的MS/MS图见图7。

2.4.7 秦皮啶 峰7的tR为10.4 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=223[M+H]+，相继脱去一分子、两分子甲基分别形成特征碎片m/z=208[M+H-CH3]+、m/z=193[M+H-2CH3]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=165[M+H-2CH3-CO]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=137[M+H-2CH3-2CO]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C11H10O5；相对分子质量理论值为223.062 66、实测值为223.060 1，誤差为-2.91 ppm。据文献报道[7，17]，防风中含有秦皮啶，其相对分子质量为223，因此判断该化合物可能为秦皮啶，峰7的MS/MS图见图8。

2.4.8 异欧前胡素 峰8的tR为12.5 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=271[M+H]+，脱掉两分子CO获得 m/z=215[M+H-CO]+离子；准分子离子峰脱去一分子C5H8形成特征碎片m/z=203[M+H-C5H8]+，再脱去一分子H2O形成特征碎片m/z=185[M+H-C5H8-H2O]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=157[M+H-C5H8-H2O-CO]+；准分子离子峰脱去一分子C5H8和一分子CO形成特征碎片m/z=175[M+H-C5H8-CO]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C5H8-2CO]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C16H14O4；相对分子质量理论值为271.096 61、实测值为271.096 49，误差为-0.44 ppm。据文献报道[18]，防风中含有异欧前胡素，其相对分子质量为271，因此推测该化合物可能为异欧前胡素，峰8的 MS/MS图见图9。

2.4.9 5-羟基-8-甲氧基补骨脂素 峰9的tR为12.9 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=233[M+H]+，脱去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-CH3]+，连续再脱掉一分子、两分子、三分子CO分别形成特征碎片m/z=190[M+H-CH3-CO]+、m/z=162[M+H-CH3-2CO]+、m/z=134[M+H-CH3-3CO]+，再脱去一分子H2O形成碎片m/z=116[M+H-CH3-3CO-H2O]+；准分子离子峰直接脱去一分子甲基和一分子CO2形成特征碎片m/z=174[M+H-CH3- CO2]+；准分子离子峰脱去一分子甲基和四分子CO形成特征碎片m/z=106[M+H-CH3-4CO]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C12H8O5；相对分子质量理论值为233.044 41、实测值为233.044 45，误差为-0.17 ppm。据文献报道[5]，防风中含有5-羟基-8-甲氧基补骨脂素，其相对分子质量为233，因此推断该化合物可能为5-羟基-8-甲氧基补骨脂素，峰9的MS/MS图见图10。

2.4.10 珊瑚菜素 峰10的tR为12.9 min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=301[M+H]+，脱掉两分子CO获得m/z=245[M+H-2CO]+碎片；准分子离子峰脱去一分子甲基和两分子CO形成特征碎片m/z=230[M+H-2CO-CH3]+，再脱去一分子CO形成特征碎片m/z=202[M+H-3CO-CH3]+；准分子离子峰脱去一分子C5H8形成特征碎片m/z=233[M+H-C5H8]+，再脱去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-C5H8-CH3]+，再相继脱去一分子、两分子、三分子CO形成特征m/z=190[M+H-C5H8-CO- CH3]+、m/z=162[M+H-C5H8-2CO-CH3]+、m/z=134[M+H-C5H8-3CO-CH3]+。根据元素组成分析，该化合物分子式为C17H16O5；相对分子质量理论值为301.107 34、实测值为301.107 05，误差为-0.96 ppm。据文献报道[19]，防风中含有珊瑚菜素，其相对分子质量为301，因此推断该化合物可能为珊瑚菜素，峰10的MS/MS图见图11。

2.4.11 紫花前胡素 峰11的tR为13.2min，ESI+模式下准分子离子峰为m/z=329[M+H]+，脱去一分子C5H6O形成特征碎片m/z=247[M+H-C5H6O]+，再脱去一分子水形成碎片离子m/z=229[M+H-C5H6O-H2O]+，再脱去一分子甲基或一分子CO2分别形成m/z=214[M+H-C5H6O- H2O-CH3]+、m/z=185[M+H-C5H6O-H2O-CO2]+的特征碎片。根据元素组成分析，该化合物的分子式为C19H20O5；相对分子质量理论值为329.138 35、实测值为329.138 35，误差为0。根据文献报道[20]，防风中含有紫花前胡素，其相对分子质量为329，且在相同MS条件下峰11与紫花前胡素对照品的裂解规律一致，因此判断该化合物为紫花前胡素，峰11和紫花前胡素对照品的MS/MS图见图12。

3 讨论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法对防风药材香豆素类成分进行了全面分析，该方法具有高分离度、高分辨率、高质量精度和高灵敏度等特点[21]。通过非目标筛选并解析11个成分，理论相对分子质量与实测相对分子质量误差均小于5 ppm。香豆素是继色原酮后防风药材中另一主要药效物质基础，其中的异欧芹素乙对小鼠腹腔巨噬细胞体外释放肿瘤坏死因子具有显著的抑制作用[22]；伞形花内酯、东莨菪素能明显抑制组胺及蛋清诱发的大鼠足肿胀，其作用可持续4 h以上，均显示出较强的抗炎活性[23]；补骨脂素、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素对乳腺癌及前列腺癌细胞具有抗肿瘤作用，二者通过抑制线粒体脂质过氧化来保护线粒体功能，均具有良好的抗氧化作用[24]；异欧前胡素具有显著的镇痛作用，能明显抑制热板所致的小鼠疼痛[25]；紫花前胡素对脂多糖损伤的人急性单核细胞白血病细胞THP-1具有保护作用，能够降低炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的分泌，对相关炎症疾病具有保护作用[26]。

本研究作为防风药材质量标志物的前期研究，明确了防风香豆素成分裂解规律，后期本课题组会继续对防风药材的体内入血成分进行分析，并结合该结果进一步确定防风药材的质量标志物，为防风的全面质量评价奠定基础，并为阐明防风道地性成因打下基础。

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（收稿日期：2018-07-27 修回日期：2018-11-28）

（编辑：林 静）