甘蔗SPSB基因5′侧翼序列的克隆及生物信息学分析

曹辉庆 黄诚梅 蒋胜理 罗海斌 邓智年 吴凯朝 徐林 魏源文

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成途径的关键限速酶，对蔗糖的合成和碳水化合物的分配具有重要的调控作用。采用染色体步移法技术克隆获得了甘蔗SPSB基因5′端侧翼序列，并对其序列进行生物信息学分析。分离获得了4 399 bp的5′侧翼序列，该序列除具有启动子核心序列 TATA-box 和增强子元件 CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件外，还含有多种光应答元件、激素响应元件，以及与缺氧、干旱、低温诱导有关的顺式作用元件和一些组织调控表达有关的顺式调控元件，表明ScSPSB启动子可能具有逆境应答、激素应答及组织特异表达特性，值得开展进一步的功能研究。

关键词：甘蔗; ScSPSB基因;侧翼序列;生物信息學分析

中图分类号： S566.101

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）15-0094-05

甘蔗属高光合效率C4植物，是我国主要的糖料作物，其蔗糖产量占我国食糖总量的90%以上。甘蔗蔗糖积累过程是甘蔗生长发育中最重要的代谢途径，与甘蔗产量和品质形成密切相关。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，简称SPS） 作为蔗糖代谢途径中的关键限速酶，其活性不仅能影响蔗糖的合成能力，还影响光合产物的分配和糖分积累[1-6]。因此，研究甘蔗SPS基因的表达调控机制对提高甘蔗产量及蔗糖含量具有重要意义。

目前，已从拟南芥[7]、荔枝[8]、水稻[9]、玉米[10]、甘蔗[11]、狼尾草[12]等多种作物中克隆到SPS基因，并进行了SPS基因家族的基因组鉴定和表达分析[7-12]。前期研究发现，植物SPS基因可分为4个家族共5种类型：SPSA（Ⅱ类）、SPSB（Ⅴ类）、SPSC（Ⅰ类）、SPSD（Ⅲ类和Ⅳ类）[13-15]，且不同植物体内不同家族的SPS基因表现出不同的表达模式和功能差异[16-21]。至今，在甘蔗中已经鉴定出5个SPS基因家族，桂意云等对其中的4个家族SPS基因进行了时空表达特性分析[18]。研究表明，在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期，SPSDⅢ基因在所有甘蔗品种的未成熟叶片、成熟叶片和茎中均高水平稳定表达;SPSB基因在成熟叶片中几乎不表达，而以茎中表达量最高; 在蔗糖积累后期，SPSA和SPSC基因在不同组织中的表达量比蔗糖积累前期均有所下降。Verma等采用半定量RT-PCR技术，测定了不同发育阶段的高、低糖甘蔗品种的节间SPS活性及转录表达水平，发现成熟节间中SPS活性和转录表达均高于未成熟节间;与低糖品种相比，高糖品种在所有发育阶段均表现出更高的SPS转录表达和酶活性，SPS活性与蔗糖呈正相关关系，与己糖呈负相关关系[19]。目前认为SPS的活性受到植物生长发育[18-19]、光照[7，22-23]、温度[24-25]、代谢产物[26]、外源物质如激素[27]等多种因素的复杂调控，但对于SPS基因的调控机制和功能特性尚未有清楚的解析，还有待进一步深入研究。

基因的表达受转录水平、翻译水平及蛋白质加工水平等不同调节因素的控制，其中转录水平的调控是主要的。位于基因5′上游的启动子被认为是调节基因转录的主要因素，对转录效率起到直接的调控作用。本研究以甘蔗新台糖22（ROC22）为试验材料，在前期获得甘蔗SPSB基因的基础上，首次克隆了甘蔗SPSB基因（ScSPSB）5′侧翼序列，并进行了启动子区域分析，为进一步研究SPSB启动子的生物学功能提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蔗（Saccharum officinarum）栽培品种新台糖22（ROC22）为广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室基地种植。菌种与质粒：克隆载体pMDTM19T和大肠杆菌感受态细胞JM109均购于宝生物工程（大连）有限公司。主要试剂：TaKaRa Tks Gfles DNA Polymerase、TaKaRa Genome Walking kit、DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

以甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA 序列（JN584485.1）作为参考序列，甘蔗基因组DNA为模板，设计了2对特异性引物扩增SPSB DNA序列。其中正反向引物：F1：5′-GGGAAC GAGTGGATCAATGG-3′;R1：5′-GTCAGACCAGACGGTAAG GT-3′。F2：5′-AATGGGTACCTGGAGGCGAT-3′; R2：5′-TGACAGATCCTCGGCCAGGT-3′。使用50 μL反应体系，各反应物配比参照TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase说明书。PCR反应程序：94 ℃预变性1 min;98 ℃变性10 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃ 延伸60 s，30个循环。反应结束后，扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用胶回收剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit对PCR产物进行回收和纯化。纯化回收目的片段与pMD19-T载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞。热挑取阳性菌落，提取质粒，由宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.3 SPSB基因5′侧翼序列的克隆

采用染色体步移法技术PCR扩增甘蔗SPSB基因5′端未知侧翼序列，具体操作方法参照TaKaRa Genome Walking kit说明书。根据已经过验证的序列设计3个特异性引物SP1（5′-CAAGCAGCGAGAGATTAACCGA-3′）、SP2（5′-GCCAGATCCGCCAGCACATGTT-3′）和SP3（5′-CCTCCTCG ACGAAGTAGTGCGA-3′）作为下游引物;试剂盒提供兼并引物AP1、AP2和AP3作为上游引物，甘蔗基因组DNA为模板，进行巢式PCR反应。取第一、二、三次的PCR产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

采用TaKaRa公司的胶回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化。胶回收产物与pMD19-T载体连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性菌落，提取质粒，由宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.4 侧翼获取序列验证

根据获取的侧翼序列，设计引物F3：5′-CCGCGTGTGAATCGTAGAAG-3′，作为上游引物。SP1作为下游引物，进行PCR扩增。PCR反应程序：94 ℃预变性 1 min;98 ℃变性 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 60 s，30个循环。反应结束后，扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 序列分析

采用NCBI的Blastn在线软件进行序列比对分析;采用在线启动子分析软件Neural Nerwork Promoter Predition（http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl）進行核心启动子和转录起始位点预测;采用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析启动子区域包含的启动子区的核心元件。PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/） 对启动子区域进行分析。

2 结果与分析

2.1 甘蔗SPSB DNA序列的克隆

电泳结果（图1）显示，可以明显扩增到G1-PCR产物条带。切胶回收G1扩增产物条带，纯化目的条带连接T载体，筛选克隆测序，测序结果显示片段大小1 388 bp，可以找到扩增引物F1和R1，以及测序引物P1的反向互补序列。将片段进行BLASTn比对，发现该序列与已知序列的部分区域具有96.79%相似性，表明所克隆片段为甘蔗SPSB DNA片段。

2.2 染色体步移法PCR扩增甘蔗SPSB基因5′侧翼序列

采用染色体步移法技术PCR扩增克隆甘蔗SPSB基因5′端未知侧翼序列（图2）。切胶回收第2次巢式PCR反应产物 AP3大小约700 bp和600 bp的扩增产物条带;第3次巢式PCR反应产物AP3大小约5 000 bp的扩增产物条带;第3次PCR反应产物 AP4大小约1 200 bp的扩增产物条带，分别使用引物SP2、SP3纯化产物进行测序。根据测序结果，将与已知序列有相关性的扩增片段回收，连接pMDTM19T载体并转化大肠杆菌感受态细胞JM109，筛选阳性菌落，提取质粒，进行克隆测序。测序结果显示片段大小为4 367 bp和 4 368 bp，可以找到扩增引物SP3，并且测序结果的3′端具有引物SP3上游SPSB基因组序列，说明该片段是ScSPSB 5′端上游特异目的片段。将该片段进行BLASTn比对，发现其与已知甘蔗ROC22 SPSB基因mRNA序列部分区域具有9780%相似性，表明5′端获得的未知序列是根据已知序列得到的。

2.3 侧翼获取序列验证及序列分析

电泳检测结果表明，可以明显扩增到与预计长度大小一致的目的片段（图3）。所扩增片段的3′端与前述克隆的甘蔗SPSB基因DNA片段5′端序列是连续存在的。采用染色体步移法分离到了甘蔗SPSB基因5′侧翼序列，序列提交GenBank，查询登录号MH074882，为公共数据库首次提交的甘蔗SPSB基因5′侧翼序列。

利用http：//www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl进行核心启动子和转录起始位点预测。结果发现在序列270～320 bp、2 458～2 508 bp、2 466～2 516 bp、3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp、3 990～4 040 bp、4 252～4 302 bp 处，预测值分别为0.97、0.84、0.98、1.00、1.00、097、0.84，预测的转录起始位点的碱基分别是A、C、T、C、G、A、G，3 201～3 251 bp、3 853～3 903 bp处为最有可能的转录起始位点。

使用Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行甘蔗SPSB基因启动子区域分析，结果见图4。预测结果显示甘蔗SPSB启动子除包含核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外，还含有多种光应答元件Sp1、MNF1、TCCC-motif、G-Box，多种激素响应元件TGACG-motif、CGTCA-motif、ABRE，与缺氧诱导有关的顺式作用元件GC-motif，低温响应元件LIR，种子特异性调控的顺式调控元件RY-element，此外还包含干旱诱导MYB和MYBHv1结合位点。

3 讨论与结论

蔗糖磷酸合成酶是植物体内控制蔗糖生物合成的关键酶，起着调节蔗糖生物合成的作用。启动子作为基因编码区域上游的非编码DNA序列，在植物基因表达调控过程中起着重要作用[28-29]。本研究采用染色体步移法首次分离克隆了甘蔗SPSB基因5′侧翼序列，通过对SPS启动子区域分析，确定甘蔗SPSB启动子除包含核心启动子元件TATA-box和增强子元件CAAT-box外，还含有光应答元件GT1-motif、MNF1、Sp1、TCCC-motif、G-Box，多种激素响应元件ABRE、P-box、CGTCA-motif、TGACG-motif、TCA-element，以及与缺氧、干旱、低温诱导有关的顺式作用元件和一些组织调控表达有关的顺式调控元件。

目前，SPS启动子已在拟南芥[7，16]、水稻[30-31]、甘蔗[32-33]、番茄[34]、棉花[35]等植物中被分离并进行功能研究。研究表明，植物SPS启动子上存在多种顺式调控元件，如ACE、AE-box、G-Box、AT1-motif、I-box、TGACG-motif、GT1-motif和MBS等，位于SPS启动子区的特异调控元件调控基因的转录表达。如SPS启动子上存在I-box和G-box，这是光调控基因启动子所必需的重要功能调控元件[36]。拟南芥SPS启动子研究表明光照对SPS基因的表达以及转录后调控至关重要[30]。与干旱诱导有关的MYB结合位点（MBS）也存在于SPS启动子中，这在拟南芥渗透胁迫诱导SPS基因研究中已有报道[16]。番茄SPS启动子区域预测存在多种顺式调控元件：光响应元件ACE、G-box、AE-box、as-2-box，参与防御和应激反应的顺式作用元件TC-rich repeats、HSE，激素反应元件ABRE、GARE-motif等，通过启动子活性的瞬时表达分析，发现该启动子在番茄的所有组织中均有表达，并受光照、应激和激素反应的调控[34]。

SPS是一个多基因家族，植物体内不同家族SPS基因的表达模式和调控模式各不相同[20-21，37]。关于甘蔗SPS基因启动子研究主要集中于SPSⅢ（A家族）启动子的研究。在甘蔗SPSⅢ（A家族）启动子研究中发现SPSⅢ启动子区上除了存在典型启动子结构外，还存在多种光响应元件ATCT-motif、ACE、AE-box、G-Box和一些与分生组织、芽组织特异性表达相关的顺式调控元件CAT-box、as-2-box，但未见本研究SPSB启动子所包含的激素响应元件和干旱、低温诱导有关的顺式作用元件[32-33]。这可能在一定程度上诠释了同一植物不同家族SPS基因表达模式及调控机制不同。

本研究首次分离克隆了甘蔗SPSB基因5′侧翼序列，并进行了启动子区域分析。分析表明甘蔗SPSB基因5′侧翼序列含有典型的启动子核心元件和多种顺式调控元件。结合已有研究基础，根据分析结果推测甘蔗SPSB基因的转录表达可能在一定程度上受组织生长发育、光照、激素、逆境胁迫等多种因素调控。要弄清SPSB基因的调控机制和功能，还须进一步研究论证。

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