IRS1/PI3K/Akt信号通路在Ang(1～7)调节非酒精性脂肪性肝炎中的作用

张艺军 邹瑞 钟武装 蔡敏捷 许桂英 乐德 刘岗

(1中国人民解放军南部战区总医院干部病房二科，广东 广州 510010；2广州医科大学附属口腔医院 广州口腔疾病研究所 口腔医学重点实验室)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作为一种代谢性肝损伤性疾病，其发病率正在逐年上升。长期NASH可以进一步进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，然而其发病机制目前尚不明确，也缺乏有效的预防措施。胰岛素抵抗是公认的产生NASH的重要环节。研究提示，血管紧张素(Ang)(1～7)能在一定程度上改善细胞胰岛素抵抗状态，从而抑制NASH的进展〔1〕。但Ang(1～7)与胰岛素受体底物(IRS)1/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝/苏氨酸激酶(Akt)胰岛素信号通路之间的调控关系还尚未见系统研究。本研究拟分析IRS1/PI3K/Akt信号通路在Ang(1～7)调节NASH中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 胎牛血清(GIBCO，美国)，胰蛋白酶(Sigma，美国)，DMEM培养基(GIBCO，美国)，油酸(赛哲生物，广州),二甲基亚砜(DMSO，赛哲生物，广州)，油红(赛哲生物，广州)，Ang(1～7)(PhoenixBiotech,德国)，AngⅡ(Sigma，美国)，A779(晶欣，深圳)，总胆固醇试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF)-α购自CUSABIO(武汉)，AKT1(AF0836)、PI3K抑制剂(AF6241)、兔PI3-kinase(AF6241)、兔IRS1(AF6273)及多克隆抗IRS1抗体购自美国AFFINITY公司 ，人肝细胞L02细胞购自中科院上海细胞库。

1.2NASH体外模型建立 L02细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，加入20 mg/ml油酸(以0.5%DMSO溶解)诱导肝细胞脂肪变性，隔天换液并加入新配制的油酸。分别接种于96孔细胞培养板，72 h后细胞发生脂肪变。光镜观察细胞内脂肪油红染色情况。

1.3实验分组 将细胞加入培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养48 h，细胞分为阴性对照组、Ang(1～7)处理组、AngⅡ处理组、Ang(1～7)+A779处理组，每组细胞数约5×106个。对照组为脂肪变肝细胞，未加任何干预因素。处理组分别加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L Ang(1～7)和10-6mol/L MAS拮抗剂(A779)共同干预及10-6mol/L AngⅡ干预。细胞继续培养24 h后，取细胞上清液进行检测。每组分别重复3次测量。

1.4检测各组细胞上清液中TNF-α、ALT、总胆固醇、葡萄糖转运蛋白(GLUT4)含量 将细胞接种于6孔板中，待细胞完全贴壁生长至60%～80%融合时，分别加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L AngⅡ及10-6mol/L Ang(1～7)和 10-6mol/L MAS拮抗剂(A779)共同干预，对照组不加任何试剂，继续培养24 h，再收集细胞的上清液。按照说明书操作步骤进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测各组细胞上清液中TNF-α、ALT、总胆固醇、GULT4的含量。

1.5逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IRS1 mRNA表达 总RNA提取，逆转录合成cDNA,引物设计为β-actin上游引物：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。IRS1上游引物：5′-AAGCACCTATGCCAGCATCAAC-3′，下游引物:5′-GAGGATTGCTGAGGTCATTTAGGTC-3′。RT 和PCR体系均为25 μl。反应条件:95℃ 变性 30 s,60℃ 退火60 s,72℃ 延伸15 s,40个循环。 扩增产物琼脂糖凝胶电泳,EPSON Perfection 2480 Photo扫描仪(爱普生公司产品)扫描条带,SmartView 2000生物电泳图像分析软件(上海复日科技有限公司产品)对条带密度进行密度定量分析,与标准化的β-actin条带密度扫描值作对比后测定其表达情况。

1.6Western印迹检测PI3K及Akt蛋白表达 取30 μg蛋白上样，10%分离胶和5%浓缩胶电泳。350 mA进行恒流电转移。一抗封闭后过夜，再二抗孵育1 h。洗膜后置暗室中，等体积混合发光缓冲液A与B，均匀滴加到聚偏氟乙烯(PVDF)膜的蛋白面上。压X光胶片1～10 min，显影后定影，Gel-ProAnalyzer分析蛋白条带的灰度值。

1.7统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1脂肪变肝细胞的构建 脂肪变肝L02细胞经油红O染色后，可见大量脂质集聚的红染颗粒积聚，见图1。

2.2各组总胆固醇、ALT、GLUT4的变化情况 Ang(1～7)组总胆固醇、ALT含量显著低于阴性对照组，GLUT4含量显著高于阴性对照组(P<0.05)。AngⅡ组、Ang(1～7)+A779组总胆固醇、ALT、GLUT4含量与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3各组IRS1基因活性、磷酸化(p)-PI3K、Akt及TNF-α的表达变化 Ang(1～7)组IRS1基因活性增强，p-PI3K、p-Akt表达水平升高，TNF-α表达量下降，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。AngⅡ组与Ang(1～7)+A779组IRS1基因活性减弱，p-PI3K、p-Akt表达水平下降，AngⅡ组TNF-α表达量升高，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 经油红染色的NASH细胞模型(×400)

表1 各组细胞培养上清液中ALT、总胆固醇、GLUT4水平比较

与阴性对照组比较：1)P<0.05；下表同

表2 各组IRS1、p-PI3K、p-Akt、TNF-α表达量比较

3 讨 论

NASH正成为全球最常见的慢性肝病，其患病率为20%～30%，在一些特殊人群中其患病率更高，据统计，2型糖尿病患者中有70%合并该病，而在肥胖者中其患病率高达90%〔2〕,NASH的发病机制复杂〔3,4〕。2004年，Wang等〔5〕首次提出胰岛素抵抗的定义，并认为胰岛素信号传递受阻或减弱，是导致胰岛素抵抗的主要原因。胰岛素抵抗可减弱和破坏胰岛素对脂肪代谢的调节，增加脂质溶解，提高循环中游离脂肪酸浓度，促进肝脏游离脂肪酸的摄取和肝细胞内三酰甘油的合成，促使三酰甘油在肝细胞内蓄积，导致NASH的形成〔6〕。Promrat 等〔7〕发现胰岛素增敏剂可使NASH患者的生化指标和肝脏组织学特征获得改善。迄今，胰岛素抵抗被公认为NASH的核心机制。NASH发病机制的“二次打击”假说〔8〕认为，脂肪蓄积通过脂毒性作用，诱导过氧化作用、氧化应激、炎症、细胞凋亡、纤维化等二次打击的发生。脂肪组织(尤其是内脏性脂肪)的增加伴随胰岛素增敏因子、抗炎因子的减少及致炎因子的增加，炎症因子反过来通过调节脂肪细胞分泌代谢而增强胰岛素抵抗。 Najjar等〔9〕证明，单核细胞趋化蛋白(MCP)-1通过募集巨噬细胞在脂肪组织中产生炎症，加重脂肪肝和胰岛素抵抗。在动物模型和NASH患者中，肝脏核因子(NF)-κB表达显著增加，活化的NF-κB通过上调白细胞介素(IL)-6、TNF-α等水平介导肝脏炎症，加重胰岛素抵抗。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)广泛存在于各种组织器官。血管紧张素转换酶(ACE)-AngⅡ- AngⅡ 1型受体轴(AT1R)是其主要分支。多项研究证实〔10～12〕，ACE抑制剂和AngⅡ受体阻断剂可以阻断2型糖尿病的进展，发挥改善胰岛素抵抗的作用。ACE2-Ang(1～7)-MAS轴作为RAS分支，抑制ACE-AngⅡ-AT1R轴的内在调节途径，对多种组织器官具有保护作用〔13～15〕。Ang(1～7)在体内外与AT1R竞争性结合，拮抗AngⅡ活性，被认为是内源性AngⅡ的阻断剂〔16〕。 Ang(1～7)可以完全阻断AngⅡ对肾近曲小管上皮细胞、人内皮细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2的磷酸化作用，该阻断作用可以被MAS受体阻断剂A779所抑制。

本研究提示，AngⅡ能对肝细胞造成持续性损伤，Ang(1～7)有改善肝细胞功能的作用。 A779作为Ang(1～7)的拮抗剂，阻断Ang(1～7)对肝细胞的保护作用，具有反向调节功能。GLUT4是一类嵌于细胞膜上用于转运葡萄糖的蛋白质载体，在机体摄取葡萄糖及代谢葡萄糖过程中发挥重要作用，葡萄糖的代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，其表达水平直接影响机体对葡萄糖的利用，也被称为胰岛素反应性蛋白〔17〕。进一步研究抑制胰岛素抵抗的分子调控机制发现，脂肪变肝细胞L02细胞中IRS1基因表达升高，p-PI3K、Akt表达水平升高，TNF-α水平下降。在IRS1/PI3K/Akt信号通路中，IRS1是一种能够被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶作用的底物，机体内的胰岛素通过特异性地结合胰岛素受体，激活IRS1等底物进而发挥调控血糖的作用。而PI3K/Akt信号通路是经典的胰岛素信号转导的主要途径〔18〕,当胰岛素与细胞表面胰岛素受体结合后，激活IRS1蛋白酪氨酸的磷酸化，进而使PI3K磷酸化，产生瀑布效应，使得Akt磷酸化被激活，并促使GLUT4转位，调节葡萄糖的吸收。相反，则可能导致胰岛素抵抗〔19〕。Zhang等〔20〕研究表明， 一种肝脏保护剂(SIL)能够通过IRS1/PI3K/Akt 信号通路改善脂肪变肝细胞和胰岛素抵抗。也有研究表明，当IRS1/PI3K/Akt信号通路被激活后，能够将更多的GLUT4从细胞内转移到细胞膜，从而增加细胞对葡萄糖的摄取〔21〕，与本实验结果相一致，说明Ang(1～7)还可以通过PI3K/Akt/TNF-α信号途径降低肝细胞凋亡，改善NASH。

综上，Ang(1～7)可以通过IRS1/PI3K/Akt信号通路提高细胞膜GLUT4含量，同时减少TNF-α的表达，减少肝细胞中胆固醇、ALT含量，改善胰岛素抵抗，从而达到减轻NASH的作用。