全自动SPE-HPLC-DAD法测定熟肉制品中15种合成色素

刘 梅,梁琳超,李 帅,张禧庆,王明林

(1.烟台杰科检测服务有限公司,山东 莱阳 265231;2. 山东农业大学食品科学与工程学院,山东 泰安 271018)

合成色素因为着色力强、性质稳定、价格便宜、用量少等优点[1],在食品加工中得到了广泛的应用．GB 2760—2014中对各种食用色素的使用范围和用量有严格的限定范围，允许用于肉及肉制品的红色色素仅有赤藓红、诱惑红和胭脂红,且有明确的限量标准:胭脂红只能用于可食用动物肠衣类,限量为0.025 g/kg;赤藓红只能用于肉罐头、肉灌肠类,限量为0.015 g/kg;诱惑红只能用于肉灌肠类、西式火腿类、可食用动物肠衣类,限量分别为0.015 g/kg、0.025 g/kg、0.05 g/kg;其他色素均为肉制品中禁用色素．

用于色素检测的常用方法有示波极谱法[2]、毛细管电泳法[3]、高效液相色谱法[4-7]、液质联用法[8-10]．示波极谱法应用较少,毛细管电泳法常用于饮料、酒类等液体样品色素检测,高效液相色谱法、液质联用法则可以应用于更复杂的食品基质．其中高效液相色谱仪的应用最为广泛．当前的检测标准涵盖的检测项目相对较少,基质类型比较简单[11-14]．本研究利用全自动固相萃取仪,建立了熟肉制品中15种合成色素的液相检测方法,能够更快速准确地对熟肉制品中的色素进行检测．

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂药品 乙腈、甲醇、正己烷(色谱纯,德国Merck公司);乙酸铅、硫酸、柠檬酸、乙醇、氨水、亚铁氰化钾、乙酸锌(分析纯,天津科密欧公司);钨酸钠(分析纯,天津市瑞金特化学品有限公司);乙酸铵(优级纯,美国Riedel-dehaen公司),冰乙酸(HPLC级,天津科密欧公司)．实验用水为Milli-Q纯水;酸性蓝1、喹啉黄、酸性橙Ⅱ、亮黑PN标准品购自Dr. Ehrenstorfer,纯度分别为100 %、98.0 %、87.0 %、85.6 %;专利蓝V标准品购自美国ACROS ORGANICS,纯度92.0 %;偶氮玉红标准品购自东京化成工业株式会社,纯度95.0 %;诱惑红、赤藓红标准品购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司,浓度均为1 000 μg/mL;胭脂红、日落黄、苋菜红、亮蓝、柠檬黄、胭脂红标准品购自中国计量科学研究院,浓度均为500 μg/mL;新红标准品购自农业部环境保护科研检测所,浓度100 μg/mL．

1.1.2 设备材料 高效液相色谱仪(美国Agilent公司,Agilent 1100);食品加工机(美国Braun公司);电子天平(中国常熟市双杰测试仪器厂,JJ500);电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司,AB135-S);超纯水器(美国Millipore公司,Advantage A10);全自动固相萃取仪(睿科仪器有限公司,Fotector Plus);氮吹仪(美国Organomation公司,OA-SYS);漩涡混合仪(美国Scientific Industries公司,Vortex-enie2);低速冷冻离心机(Thermo Scientific Heraeus Multifuge,X3R);离心管(50mL);固相萃取柱:OASIS WAX(3 mL,60 mg,WATERS);OASIS HLB(60 mg,3 mL,WATERS)、NH2(500 mg,3 mL,色谱科)、聚酰胺(500 mg,6 mL,上海安谱);色谱柱: Gemini-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Phenomenex)

1.2 样本来源及分类

熟肉制品样本来源于山东地区17个市的正规商超及知名品牌专卖店．样本共计1 665个,在17个市的分布为不规则分布．

根据食品添加剂使用标准[14]中对肉及肉制品(08.0)的分类,样本来源涉及到以下肉制品:腌腊肉制品类(08.02.02)、酱卤肉制品类(08.03.01)、熏烤肉类(08.03.02)、西式火腿类(08.03.04)、肉灌肠类(08.03.05)、其他熟肉制品(08.03.09)、肉制品的可食用肠衣类(08.04)．

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理方法 称取样品2.00 g至50 mL离心管,加入10 mL乙醚萃取脂肪后弃掉,加入15 mL氨化乙醇水(1+70+30)溶液,涡旋振荡5 min,5 000 r/min离心5 min,将上清液转移到另一50 mL离心管中,残渣如上操作重复提取一次,合并2次上清液,70 ℃下水浴氮吹,将样液浓缩至约10 mL左右,加入0.5 mL硫酸(2/3 mol/L)、0.5 mL钨酸钠溶液(5%)沉淀蛋白,5 mL正己烷除油脂,涡旋振荡2 min,4 000 r/min离心5 min,取中间清液,待净化．WAX固相萃取柱预先用3 mL甲醇、3 mL水活化,加入提取液,弃去流出液．3 mL水,3 mL甲醇淋洗,10 mL氨化甲醇(5%)洗脱,收集洗脱液,70 ℃水浴N2吹至近干,用pH值为9的甲醇水(4+6)定容至1 mL,过0.22 μm PTFE滤膜,上机测试．

1.3.2 液相色谱条件 流动相:A为0.02mol/L乙酸铵水溶液,B为乙腈,C为甲醇.梯度洗脱条件见表1．

表1 梯度洗脱程序

色谱条件:色谱柱:Gemini-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm,美国Phenomenex);柱温40 ℃;进样量10 μL;检测波长:430 nm(柠檬黄、喹啉黄);508 nm(新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、红色2G、偶氮玉红、酸性橙Ⅱ、赤藓红);635 nm(亮蓝、酸性蓝1、专利蓝V);578 nm(亮黑PN)．

2 结果与讨论

2.1 检测方法条件的优化

2.1.1 提取溶剂选择 熟肉制品含蛋白及脂肪较多,提取时需要有一定比例的有机试剂加入,便于提取、浓缩及沉淀蛋白．

不同比例乙醇-水-氨水体系(其中氨水体积比为1不变,乙醇、水体积总和为100,pH值约为10)的提取液的提取回收率见表2．由表2可知，随着乙醇比例的增加,色素的提取回收率增加,尤其是偶氮玉红、酸性橙Ⅱ、赤藓红、亮黑PN有明显增加．在乙醇-水-氨水(70+30+1)比例下,各种化合物回收率为75.2%～115.2 %,达到最佳，故选择乙醇-水-氨水(70+30+1)作为提取溶液．

2.1.2 沉淀剂选择 为了减少熟肉制品样品在浓缩时的蛋白析出,选择了3种沉淀剂进行比较:乙酸锌-亚铁氰化钾溶液(pH值5.1)、硫酸-钨酸钠溶液(pH值1.6)、乙酸铅溶液(pH值5.7)．对于纯水标准溶液沉淀后回收率结果见表3．其中以硫酸-钨酸钠沉淀后回收率最好,且沉淀后溶液不需再调节pH即可上柱．所以,最终选择硫酸-钨酸钠作为沉淀剂．

表2 不同提取溶剂的回收率结果(n=3)

2.1.3 固相萃取柱选择 所研究的15种色素,除赤藓红外,其他14种均带有磺酸基,属于一种酸性较强的基团,适宜于用弱阴离子交换固相萃取柱进行净化．

选择了HLB、WAX(60 mg,3 mL)、NH2(500 mg,3 mL)、聚酰胺(500 mg,6 mL)4种SPE柱进行了试验．试验结果(表4)表明,使用HLB柱净化时柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮黑回收率较差;使用NH2柱净化后酸性蓝1、专利蓝V、喹啉黄回收率较差;使用WAX柱和聚酰胺柱净化后的回收结果较好,因聚酰胺柱洗脱液稍显浑浊,浓缩时间较长,因此最终选择WAX柱作为固相萃取净化柱．

2.1.4 检测波长选择 所研究的15种色素均在可见光波长下有很好的吸收,因此选择可见光波长作为检测波长,也可以减少在紫外波长下的杂质干扰,且获得更好的检测灵敏度．通过对15种色素标准溶液进行波长扫描得到以下数据:柠檬黄的最大吸收波长为430 nm,喹啉黄的最大吸收波长为418 nm,新红的最大吸收波长为508 nm和528 nm, 苋菜红的最大吸收波长为520 nm,胭脂红的最大吸收波长为510 nm,日落黄的最大吸收波长为490 nm,诱惑红的最大吸收波长为510 nm,红色2G的最大吸收波长为508 nm和534 nm,偶氮玉红的最大吸收波长为518 nm,酸性橙Ⅱ的最大吸收波长为486 nm,赤藓红的最大吸收波长为532 nm,亮蓝的最大吸收波长为630 nm,酸性蓝1的最大吸收波长为635 nm,专利蓝V的最大吸收波长为635 nm,亮黑PN的最大吸收波长为578 nm．

表3 不同沉淀剂沉淀后回收率结果

表4 不同SPE柱回收结果

综合考虑,设置了4个检测波长通道对15种色素进行数据采集:在430 nm检测柠檬黄、喹啉黄;在508 nm检测新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、红色2G、偶氮玉红、酸性橙Ⅱ、赤藓红;在635 nm检测亮蓝、酸性蓝1、专利蓝V;在578 nm检测亮黑PN．在此条件下,各种化合物均能得到较好的灵敏度(图1)．

2.1.5 色谱流动相选择 梯度洗脱通常会选择2种流动相．在本研究中,因为色素种类比较多,2种流动相不能很好地分离各种色素,最终选择了3种流动相进行梯度洗脱:乙腈、甲醇、0.02mol/L乙酸铵．其中甲醇因为粘度较大,比例改变带来的柱压变化较大,因此选择恒定比例,其余2种产生梯度变化进行洗脱,得到了很好的分离效果,各种色素均达到了基线分离．各种合成色素分离色谱图及保留时间见图1．

2.1.6 色谱柱选择 试验了XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Agilent)、Gemini-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Phenomenex)、SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Agilent)、TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国Agilent)4种色谱柱的分离效果．

所用流动相为乙酸盐缓冲液,pH值范围3.8～5.8．在此范围内,4种柱子均可以使用．由于4种色谱柱在孔径、比表面积、碳载量上有较大的差别(表5),最终导致分离效果差异比较明显．高比表面积和高碳覆盖率均可以提高组分的分离和保留能力．在SB-C18和TC-C18色谱柱上,赤藓红和酸性橙Ⅱ分离较差;在XDB-C18色谱柱上,新红和苋菜红分离较差;Gemini-C18的分离效果最好．

随着定容液中有机相比例的增高,新红、苋菜红、胭脂红的溶解性变差,峰形也越来越差．在SB-C18色谱柱上在定容液中有机相比例达到30 %时就出现了新红峰形变宽、苋菜红峰分叉的现象,Gemini-C18在定容液中有机相比例达到40 %时仍具有良好的峰形．因此,最终选择Gemini-C18作为色素分离用的色谱柱．

2.2 方法学考察

表5 不同色谱柱的参数

1.柠檬黄(Rt 5.482); 2.喹啉黄(Rt 15.691); 3.新红 (Rt 5.552); 4.苋菜红(Rt 6.427); 5.胭脂红(Rt 8.418); 6.日落黄(Rt 9.670); 7.诱惑红(Rt 11.240); 8.红色2G(Rt 11.719); 9.偶氮玉红(Rt 14.158); 10.酸性橙Ⅱ(Rt 18.448); 11.赤藓红(Rt 19.072); 12.亮蓝(Rt 14.743); 13.酸性蓝1(Rt 17.237); 14.专利蓝V(Rt 18.771); 15.亮黑PN(Rt 9.290).

图1各种合成色素分离色谱图

Fig.1 Separation chromatogram of different synthetic pigments

2.2.1 线性关系及检出限 采用标准工作液进行标准工作曲线的制作,以目标化合物的峰面积(y)为纵坐标,质量浓度(x,μg/mL)为横坐标绘制工作曲线,得到线性回归方程,相关系数r均大于0.999,表明各化合物在相应的浓度范围内线性关系良好,15种合成色素的定量限(10倍信噪比)可以达到0.02～0.12 μg/mL(表6),能够满足食品标准要求．

2.2.2 回收率与精密度 在熟肉制品空白样品中添加1倍定量限、2倍定量限、10倍定量限水平浓度的标准物质,分别进行6平行添加回收实验,以标准曲线进行外标法定量,回收率范围为72.05%～99.39%,相对标准偏差为0.36%～9.23 %,结果见表7．

2.2.3 实际样品检测 利用本方法对市售熟肉制品进行检测,共检测样品1 665个[15]．其中肉灌肠(840个样品)中和西式火腿(185个样品)中检出诱惑红比例较高,分别为57.74 %、51.89 %,检出值在0.035 ～12.5 mg/kg,均未超出限量范围;酱卤肉类(372个样品)检出小于定量限的色素一种:诱惑红,检出率为0.81 %;腌腊肉制品(126个样品)中检出小于定量限的色素3种:柠檬黄、日落黄、诱惑红,检出率分别为2.38 %、2.38 %、1.59 %;肉制品的可食用肠衣类(20个样品)检出一种允许使用的色素:胭脂红,检出率5.00%,检出值0.52 mg/kg,在限量标准范围内;烤肉类(85个样品)没有检出合成色素;其他肉制品(37个样品)检出小于定量限的色素2种:柠檬黄、日落黄,检出率均为2.70 %．

3 结 论

本方法主要应用于熟肉制品中的合成色素测定,运用全自动固相萃取仪进行固相萃取,大大缩短了样品预处理的时间,结合DAD检测器特有的多通道全光谱数据采集技术,可以更准确地对化合物进行定性定量．使用本研究的检测方法,一次性检测项目更多,检测灵敏度更高,检测周期大大缩短．综上所述,本方法准确可靠,重复性好,灵敏度高,适用于熟肉制品中合成色素的快速检测．

表6 15种化合物的线性范围、回归方程、相关系数、定量下限

注:线性方程中,y为响应面积,x为浓度(μg/mL).

表7 15种化合物的加标回收率、相对标准偏差(n=6)