外源硝普钠与EDTA强化黑麦草耐镉性及镉积累

张 倩，陈为峰，董元杰

（山东农业大学资源与环境学院/土肥资源高效利用国家工程实验室，山东泰安 271018）

随着工业的发展以及城市的快速扩张，我国土壤重金属污染日益严重，其中镉因在土壤中含量较高(0.05～0.38 mg/kg)[1]且对人类健康威胁较大而被确定为优先控制的重金属[2]。镉易被植物吸收积累，从而影响其生长发育，最终导致作物减产[1,3]。作物中的镉通过食物链进入人体，还会对人体重要器官造成损害，并可能导致癌症和其他致命的健康危害[4]。因此，寻找有效的修复方法以减轻土壤镉污染的社会需求十分迫切。

植物修复是一种简便有效且环境友好的土壤污染修复方法，但目前发现的超富集植物普遍具有生物量小、生长周期长等问题[5-7]。黑麦草(Lolium perenneL.)是我国北方草坪的常用草，它对镉的富集能力强、适应性广、覆盖面积大、生长速度快且产量高[8-9]。通过对黑麦草重复修剪收割，可以逐渐减少土壤中重金属离子的含量[10]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种植物体内普遍存在的气体信号分子，在植物抵抗逆境胁迫过程中起重要作用[11-12]。研究表明，NO参与了植物对重金属胁迫的反应调控[13]。硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)是一种广泛应用的金属-NO配合物，在水溶液中溶解时能够释放NO，因此普遍用作外源NO供体[14]。研究表明，外源添加SNP能够有效缓解镉对黑麦草的毒害作用[15-16]。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA)是一种人工合成的螯合剂，研究表明EDTA能够活化土壤中的重金属，促进重金属向植株地上部运输，进而提高植物对重金属的修复作用[17]。Han等[18]研究认为，EDTA处理提高了喜盐鸢尾地上与地下部Pb、Cd的积累量。还有研究表明，施用EDTA能够提高黑麦草中Pb、Cd、Zn的积累[19-20]。到目前为止，已有部分关于植物生长调节剂与重金属螯合剂联用强化植物修复效率的报道，但有关SNP与EDTA联合施用对重金属污染土壤植物修复影响的研究尚未见报道。

因此，本研究以黑麦草为研究对象，研究镉胁迫下外源添加SNP与EDTA对黑麦草生理特性及镉积累的影响，以期明确SNP与EDTA强化黑麦草修复土壤镉污染的效应与机制，为SNP与EDTA在强化植物修复土壤重金属方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018年3月在山东农业大学资源与环境学院植物营养学实验室进行。选取大小均匀、无病虫害的黑麦草(绅士)种子，经0.1%的HgCl2消毒处理后，置于SPX-2501C型人工智能气候箱中25℃下恒温培养。待种子露白后，播于洗净的蛭石中，萌发后用1/2 Hoagland营养液浇灌，1周后每盆移苗25株，完全营养液培养，营养液调pH至6.5～6.8，幼苗生长条件的室内昼/夜温度为25/18℃，光强为100 μmol/(m2·s)，光照时间 14 h/d。

1.2 试验设计

试验共设8个处理，其中4个为非Cd胁迫处理，包括Hoagland营养液处理(CK)及在营养液中加入 0.5 mmol/L EDTA(EDTA)、100 μmol/L SNP(SNP)、0.25 mmol/L EDTA 和 50 μmol/L SNP(EDTA + SNP)；另外， 4个Cd胁迫处理为以上4个处理中添加100 μmol/L CdCl2，分别记为Cd、Cd +EDTA、Cd + SNP、和Cd + EDTA + SNP，每个处理重复三次，每盆每次用250 mL配制的混合液进行处理。每2 d换一次营养液，处理18 d后进行各项指标的测定。

1.3 测定项目及方法

株高、鲜重和干重采用常规直尺测量和天平称量方法。光合色素含量采用乙醇提取、紫外分光光度法测定。

电解质渗出率采用DDS-307A电导仪测定初电导值S1，封口沸水浴20分钟后冷却并测定终电导值S2。相对电导值(%)= S1/S2× 100；电解质渗出率(%)=(样品相对电导值-对照相对电导值)/(100%-对照相对电导值)× 100。产生速率采用羟胺氧化反应法测定，H2O2含量测定参照Patterson等[21]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定采用紫外分光光度法[22]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2010 软件处理数据和绘表，采用SPSS软件进行统计分析，采用Duncan法(P＜0.05)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对Cd胁迫下黑麦草生长的影响

由表1可知，非镉胁迫下外源添加SNP和EDTA显著降低黑麦草株高和根长，与单独添加相比，二者复合添加有一定缓解作用但差异不显著。Cd处理显著抑制了黑麦草生长，与CK相比，Cd处理下黑麦草株高、根长分别降低28.3%和27.5%，鲜重和干重分别显著降低37.1%和38.0%。添加SNP能够缓解镉对黑麦草的胁迫作用，二者复合处理同样缓解了镉对黑麦草的生长抑制。其中Cd +EDTA + SNP处理的株高、根长较Cd处理分别增加了68.8%和59.6%，鲜重和干重分别显著增加了62.6%和60.0%。

表1 外源SNP与EDTA对黑麦草生长及根系活力的影响Table1 Effects of extraneous SNP and EDTA on growth and root activity of ryegrass under Cd stress

根系活力反映了植物根系的生长状况与生命力强弱。由表1可知，非镉胁迫下，外源添加EDTA、SNP及二者复合处理显著抑制了黑麦草的根系活力，较CK处理分别降低了17.5%、8.93%和4.62%；而与单独添加相比，二者复合添加显著提升其根系活力。与CK相比，Cd处理显著降低了黑麦草的根系活力。镉胁迫下，单独添加SNP与EDTA处理的黑麦草根系活力较Cd处理分别提高了34.4%和71.0%，二者复合处理下其根系活力较Cd处理提高了107%，差异显著。说明SNP与EDTA均可提高黑麦草在镉胁迫下的根系活力以促进其生长，其中二者复合施用效果更加明显。

由表2可知，非镉胁迫下，SNP和EDTA单独添加或者同时添加均显著降低了黑麦草叶中叶绿素和胡萝卜素的含量，尤以EDTA的负作用最大。镉胁迫显著降低了黑麦草光合色素的含量。与CK相比，Cd处理的黑麦草叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别降低32.2%、23.9%、22.7%。镉胁迫下，添加SNP显著提高了黑麦草Chl a、Chl b和类胡萝卜素的含量，添加EDTA没有显著作用，同时添加EDTA + SNP提高色素含量的效果显著大于SNP和EDTA单独施用。EDTA + SNP处理的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量比Cd处理分别提高了82.5%、55.6%和82.4%，甚至显著高于CK。由此说明SNP与EDTA复合处理能够明显缓解黑麦草镉胁迫，提高其耐镉性。

表2 外源SNP与EDTA下黑麦草光合色素含量(mg/g，FW)Table2 Chlorophyll contents of ryegrass affected by extraneous SNP and EDTA

2.2 不同处理对Cd胁迫下黑麦草活性氧产生的影响

如图1所示，非镉胁迫下，SNP和EDTA单独添加或者同时添加均显著提高了黑麦草的产生速率和H2O2含量，其中单独添加EDTA作用最明显。Cd处理显著提高了黑麦草的产生速率和H2O2含量。与CK相比，Cd处理下黑麦草地上和地下部产生速率分别提高了48.1%、64.0%，地上部和地下部H2O2含量分别提高了78.6%、103%，说明镉胁迫引起了黑麦草的过氧化作用。外源添加SNP与EDTA均可降低其产生速率和H2O2含量，其中二者复合施用效果最明显。与Cd处理相比，Cd + SNP +EDTA处理叶片和根系中的产生速率分别降低了29.0%和26.1%，H2O2含量分别减少了42.5%和40.2%，且均差异显著。

图1 添加SNP和EDTA黑麦草叶和根中超氧阴离子产生速率(A)及过氧化氢含量(B)Fig.1 generation rate(A)and H2O2 content(B)in leaf and root of ryegrass affected by extraneous SNP and EDTA

由图2A可见，非镉胁迫下，SNP和EDTA单独添加或者同时添加均显著提高了黑麦草丙二醛(MDA)含量。Cd胁迫下黑麦草叶片和根系丙二醛含量均显著增加，从而促使脂膜过氧化，对黑麦草产生伤害。与CK相比，Cd处理下黑麦草叶片和根系的MDA含量分别提高了104%和42.5%。添加SNP与EDTA均能减少MDA积累，其中二者复合施用效果更明显。与Cd处理相比，Cd + SNP +EDTA处理中叶片和根系MDA含量分别降低了30.4%、21.8%，且差异性显著，说明其对提高黑麦草耐镉性有较好的效果。

图2 添加外源SNP与EDTA黑麦草丙二醛含量(MDA)及电解质渗出率Fig.2 MDA content and electrolyte leakage of ryegrass affected extraneous SNP and EDTA under Cd stress

镉胁迫下黑麦草电解质渗出率显著增加(图2B)。与CK相比，Cd处理下黑麦草电解质渗出率增加了61.7%。而添加SNP与EDTA可降低其电解质渗出率，其中SNP单独施用和二者复合处理均与Cd处理差异显著。与Cd处理相比，Cd + SNP + EDTA处理下黑麦草电解质渗出率降低了31.3%，表现出较好的缓解作用。

2.3 不同处理对Cd胁迫下黑麦草抗氧化酶活性的影响

非镉胁迫下，单独添加EDTA显著抑制黑麦草地上与地下部超氧化物歧化酶(SOD)活性(图3A)，与CK相比分别降低了3.03%和10.1%。镉胁迫同样显著抑制黑麦草SOD活性，与CK相比，Cd处理下黑麦草地上部和地下部SOD活性分别降低了26.5%、40.3%。SNP和EDTA的单独与复合施用均可显著缓解这一现象。其中，复合处理对黑麦草地下部SOD活性的提高效果最为明显，与Cd处理相比，Cd +SNP + EDTA处理下黑麦草地上与地下部SOD活性分别提高了32.5%、67.6%。

过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性变化趋势与SOD活性变化趋势基本相似(图3-B、D)。与CK相比，Cd处理下二者均显著降低，其中叶片与根系中的POD活性分别降低了42.3%、17.0%，APX活性分别降低了62.9%、52.6%。但添加SNP和EDTA及二者复合处理后，POD与APX活性均有提高。与Cd处理相比，Cd + SNP + EDTA处理下黑麦草地上与地下部POD活性分别提高了49.8%、67.6%，APX酶活性分别提高了134%、102%，均具有显著的差异性。

为适应镉胁迫，Cd处理下黑麦草叶片中过氧化氢酶(CAT)活性较CK有所提高，但差异不显著(图3C)。而与CK相比，Cd处理下黑麦草根系中CAT活性显著降低了42.1%。SNP与EDTA的复合施用明显提高了黑麦草根系内CAT活性，与Cd相比，Cd + SNP + EDTA处理下黑麦草CAT活性提高了45.4%，且差异显著。

2.4 不同处理对Cd胁迫下黑麦草脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

逆境条件下植物体内脯氨酸会大量积累以增强其抗逆性。由图4A可见，在镉胁迫下黑麦草叶片和根系中脯氨酸含量均显著提高。与CK相比，Cd处理下黑麦草叶片和根系中脯氨酸含量分别增加了75.0%、115%。镉胁迫下，单独添加EDTA降低了脯氨酸含量，但单独添加SNP或二者复合施用均显著提高了黑麦草脯氨酸含量，且复合施用效果更明显。与Cd处理相比，Cd + SNP + EDTA处理下黑麦草叶片与根系脯氨酸含量分别提高了8.52%、7.43%。

图3 外源SNP与EDTA复合施用对镉迫下黑麦草SOD、POD、CAT及APX酶活性的影响Fig.3 Effects of extraneous SNP and EDTA on SOD, POD, CAT and APX activities of ryegrass under Cd stress

图4 外源SNP与EDTA复合施用对镉迫下黑麦草脯氨酸及可溶性蛋白含量的影响Fig.4 Effects of extraneous SNP and EDTA on proline and solution protein contents of ryegrass under Cd stress

黑麦草可溶性蛋白含量在镉胁迫下显著降低(图4B)。与CK相比，Cd处理使黑麦草叶片和根系的可溶性蛋白含量分别减少了47.9%和51.8%。单独添加SNP与EDTA能够提高其可溶性蛋白含量，但复合施用效果更明显。与Cd处理相比，Cd + SNP +EDTA处理下黑麦草叶片与根系可溶性蛋白分别提高89.8%、89.1%，且差异显著。

2.5 不同处理对Cd胁迫下黑麦草镉含量的影响

由图5可见，单独添加SNP能够降低黑麦草叶片中的镉含量，同时增加其根系中镉含量。而单独添加EDTA或SNP和EDTA复合施用均可显著提高黑麦草地上和地下部黑麦草镉含量。与Cd处理相比，Cd + SNP + EDTA处理下黑麦草地上与地下部镉含量分别提高了89.7%和30.2%，且差异显著，表明其能够明显提高黑麦草地上部对镉的吸收积累。

图5 外源SNP与EDTA复合施用对镉迫下黑麦草镉含量的影响Fig.5 Effects of extraneous SNP and EDTA on Cd content of ryegrass under Cd stress

3 讨论

3.1 外源SNP与EDTA复合施用对镉胁迫下黑麦草生长的影响

本研究发现，非镉胁迫下单独或复合添加EDTA与SNP均显著抑制黑麦草生长(表1)。这可能是由于EDTA的添加增强了金属的溶解性，破坏了矿质元素平衡，从而导致生物膜结构破坏，细胞代谢紊乱，植株光合色素含量减少，光合作用受到抑制，最终影响植株生长发育[23]。He等[19]研究表明，非铅胁迫下外源添加EDTA能够显著抑制黑麦草的生长，这与本实验结果一致。同时，有研究表明过量的NO能够抑制光合色素合成，破坏电子传递链，造成DNA损伤，抑制植物生长发育[24]，本试验采用的SNP浓度为镉胁迫下缓解黑麦草生长抑制的适宜浓度[15]，因此在非胁迫条件下，添加该浓度的SNP可能对黑麦草生长产生一定的抑制作用。

Cd胁迫会抑制植物生长、促使叶片失绿、根系活力下降和生物量下降，严重时甚至导致植物死亡[25]。本研究中，添加100 μmol/L的CdCl2显著抑制了黑麦草的株高、根长、干鲜重及根系活力。镉胁迫下单独添加EDTA降低了黑麦草的株高根长和叶绿素含量，这可能是由于高浓度EDTA本身对植物也存在一定的胁迫作用。但添加SNP可有效缓解镉胁迫作用，且二者复合施用效果更佳。添加SNP与EDTA可以通过提高其根系活力促进其对矿物质的吸收，同时增加光合色素的合成，能够促进其光合作用，从而提高其耐镉性。已有研究表明，SNP能够在植株体内释放NO，并通过NO调控修复镉对黑麦草生长及叶绿素合成的抑制作用[15]，这与本试验结果(表2)一致。同时，相关研究证明SNP能够通过提高Δ1-吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)活性、降低脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性，促进脯氨酸在植物体内的合成与积累[26]。而脯氨酸可以清除ROS，提高抗氧化能力，稳定生物大分子的结构[27]。本研究中游离脯氨酸在镉胁迫下能够在植物体内大量积累(图4)，而外源添加SNP与EDTA能够进一步提高黑麦草地上、地下部游离脯氨酸含量，这与前人研究结果一致[28-29]。此外，有研究证明，豆科植物最初的叶子中60%～70%的Pb以Pb-EDTA形式存在[30]。因此，二者联合施用对其胁迫作用缓解效果更好可能是由于黑麦草中的Cd大多以螯合态Cd-EDTA形式存在，使之积累在叶肉细胞的液泡内或栅栏组织的细胞内和细胞间隙，从而将有毒的镉离子隔离在原生质外[31]，同时添加SNP能够缓解EDTA本身对黑麦草的生长抑制(表1)，二者通过促进脯氨酸的合成，提高黑麦草的渗透调节能力，增强其耐镉性以此维持黑麦草的正常生长。

3.2 外源SNP与EDTA复合施用对镉胁迫下黑麦草脂质过氧化作用的影响

本研究发现，非镉胁迫下外源添加EDTA显著抑制黑麦草抗氧化酶活性(图3)，这可能是由于EDTA能够破坏矿质元素平衡致使细胞质膜受损、代谢紊乱[23]，从而严重抑制了植株抗氧化酶活性，导致活性氧簇(ROS)大量积累，影响植株正常生长。Cd胁迫下，和H2O2在植物体内大量积累，同时高浓度的Cd能够抑制植物体内抗氧化酶的活性。研究表明，ROS的积累会抑制植物的光合作用，破坏植物细胞膜结构，从而对植物的生长发育造成胁迫[32]。本研究中，Cd处理明显提高了产生速率、H2O2含量(图1)、MDA含量以及电解质渗出率，同时抑制了黑麦草中SOD、POD和APX活性(图3)，这与前人研究结果一致[15]。而外源添加SNP或二者复合施用均能缓解这一抑制作用。Fan等[33]研究表明，SNP处理下百慕大草中MDA含量明显低于无SNP的处理，这与本试验结果一致。Cd能够增加细胞膜透性，而添加外源SNP能够通过降低和H2O2的积累来减缓胁迫条件下植物的膜脂过氧化作用[34]。Dong等[35]研究表明，外源添加SNP能够有效提高镉胁迫下花生中抗氧化酶活性。而EDTA能够与Cd2+形成螯合物，缓解Cd2+取代植物体内酶中心原子造成的酶失活现象，提高镉胁迫下抗氧化酶活性。同时添加SNP能够缓解EDTA本身对抗氧化酶活性的抑制作用，因此，二者复合作用效果最佳。外源添加SNP和EDTA可能是通过二者共同作用提高黑麦草体内抗氧化酶活性，清除过量积累的ROS，并修复受损细胞，从而达到缓解对黑麦草的氧化胁迫，提高其耐镉性。

3.3 外源 SNP与EDTA复合施用对镉胁迫下黑麦草镉含量的影响

镉进入植物地上部可能通过质外体途径经由细胞间隙进行迁移，也可能通过共质体途径由原生质体通道向地上部迁移[36]。然而，研究发现Cd胁迫会加速细胞成熟，促进根部凯氏带的形成，从而使Cd不易通过质外体途径向地上部移动[37]。Qiu等[38]认为，Cd主要通过消耗能量的共质体途径在植物体内进行转运，质外体途径只占较少部分。但根系细胞内液泡的区室化作用易将共质体吸收的Cd滞留在根部[39]，因此一般植物地上部镉积累量较低。本试验结果表明，单独添加EDTA与复合施用SNP和EDTA均显著提高黑麦草地上部镉含量(图5)。有研究认为，EDTA能够与重金属螯合增加土壤溶液中的重金属含量，螯合态重金属呈中性，能够减少根表吸附而直接进入植物根系[40]。且在金属螯合物作用下，能够破坏植物根系内皮层的凯氏带[41]，使重金属更易进入根部组织并向地上部转运。

4 结论

非镉胁迫下，添加100 μmol/L SNP与0.5 mmol/L EDTA显著抑制黑麦草生长。而镉胁迫下添加外源SNP与EDTA缓解了黑麦草的脂质过氧化作用，提高其渗透调节能力，从而减轻了镉对黑麦草生长的抑制作用。同时，EDTA的添加促进了黑麦草对镉的吸收，显著提高了黑麦草地上部的镉积累量。本试验各处理中，同时添加EDTA和硝普钠的处理可提高黑麦草镉积累，并有效增强黑麦草的耐镉性，其效果最为明显。