胶陀螺多糖超高压辅助提取响应面工艺优化

钟 宝，李凤林，王英臣，刘静雪，Youn-Soo Cha

胶陀螺(Bulgaria inquinans) 又名猪嘴蘑、拱嘴蘑、胶鼓菌，主要分布在我国东北长白山一带，夏、秋季节常见于蒙古栎的倒木及树桩上。经研究，胶陀螺具有很高的药用价值，如抗癌、抑菌、光敏、抗疟疾、抗氧化、止痒、杀虫、抗血瘀等，现代科学研究表明，胶陀螺多糖具有光敏、抗肿瘤和减少血栓形成等活性[1]。目前，对于胶陀螺多糖提取方法的研究报道相对较少。超高压技术是将设备压力上升到100 MP以后，迫使细胞在超高压作用下产生细胞壁破裂，细胞内的物质能够最大限度溶出的一种方法[2-5]。随着食品加工业的发展和功能性食品生产的需要，该项技术目前广泛用于食品加工行业[6-9]。本文以为胶陀螺为原料，通过超高压辅助萃取技术提取多糖，通过单因素和响应面分析试验确定最佳提取工艺参数，为胶陀螺综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

胶陀螺采自于蛟河市黄松甸镇；超纯水，实验室制取；苯酚、硫酸、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器设备

超高压装置：包头科发高压科技有限责任公司；SBW-1型旋转蒸发仪：上海申玻仪器公司；TU1800S型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器公司；BS110S 精密电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；LXB-IIB 低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；实验室超纯水机：深圳市宏森环保科技有限公司。

1.3 工艺流程

原料→烘干→粉碎→与蒸馏水混合→超高压提取→抽滤→乙醇沉淀→去蛋白→静置过夜→离心→无水乙醇洗涤→稀释粗多糖提取液→测定。

1.4 操作要点

(1)将新鲜的胶陀螺子实体置于烘干箱中，在80 ℃的条件下烘干3 h，取出粉碎，过80目筛，制成粉末待用。(2)取粉末10 g，置于烧瓶中，加入200 mL蒸馏水溶解，之后进行超高压处理。(3)对水提液进行抽虑，加95%的乙醇至乙醇浓度达到80%进行醇沉，加入Sevag试剂脱去蛋白，加入4倍的无水乙醇沉淀，在4 ℃的条件下，静止放置12 h。(4)在4 000 r/min的条件下，离心5 min得到沉淀，之后用无水乙醇洗涤，再进行冷干，即可得到粗多糖。

1.5 多糖含量测定[10-11]

苯酚—硫酸比色法测定胶陀螺中多糖含量。

表1 响应面分析因素与水平编码值和实际值范围表

1.6 响应面试验设计[12-14]

在单因素试验的基础上，选取保压时间、料液比和超高压压力三个因素(见表1)，根据Box-Behnken设计原理，进行响应面分析试验，以胶陀螺多糖得率为响应值，每组试验重复3次，计算平均值，使用辅助软件Design-Expert 8.0.6进行随机试验。

2 试验结果和分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超高压力对试验结果的影响 在0-500 MPa的超高压条件下，对胶陀螺多糖进行提取，提取结果见图1。

图1 超高压压力对胶陀螺多糖得率的影响

图2 保压时间对多糖得率的影响

图3 料液比对胶陀螺多糖得率的影响

由图1可知，在保压时间(5 min)和料液比(1∶20 g/mL)恒定的条件下，随着超高压压力的上升，胶陀螺多糖的得率也在逐渐增加，当提取压力超过300 MPa以后，多糖得率开始呈下降趋势，原因可能是，由于压力过高导致胶陀螺细胞壁破裂，常规条件下，压力可以辅助溶液溶出多糖，但压力超过一定范围，会致使细胞完全破裂，细胞中的其他物质也随之溶出，导致杂质过多阻止了多糖的溶出。

2.1.2 保压时间对多糖得率的影响 在保压时间为0-7 min的条件下提取多糖，结果见图2。

由图2可知，在超高压压力(300 MPa)和料液比为(1∶20 g/mL)恒定的条件下，随着时间的增加多糖的得率也随之增加，当时间超过5 min后，多糖得率逐渐开始下降，原因可能是当保压时间到达5 min时，胶陀螺细胞已经破裂，如果继续增加压力，会导致细胞破裂过度，产生大量杂质，进而对多糖的溶出产生影响。

2.1.3 料液比对胶陀螺多糖得率的影响 在1∶10 g/mL-1∶30 g/mL的条件下进行多糖提取，结果见图3。

在超高压压力(300 MPa)和保压时间(5 min)恒定的条件下，溶液计量的增加，使得多糖得率也逐渐增加，当料液比超过1∶20 g/mL时，多糖得率变化不明显，在胶陀螺重量恒定的条件下，溶剂用量增加，细胞内外的多糖浓度差增大，有利于多糖的溶出，当多糖基本溶出时，继续增加溶剂的使用量，不利于后续试验的开展。

2.2 响应面试验结果和分析

2.2.1 响应面试验设计 通过单因素试验，选择超高压压力(A)、保压时间(B)和料液比(C)3个单因素为自变量，以胶陀螺多糖得率为响应值(Y)，采用响应面分析法进行三因素三水平试验(17组实验)，结果见表2。

2.2.2 胶陀螺多糖超高压辅助提取回归模型、方差分析及显著性检验 采用软件对表2中的结果进行多元回归模型拟合、方差分析及显著性分析。得到多糖得率对超高压压力、保压时间、料液比的初步回归方程为：

Y=+4.99-0.020A-0.11B+014C+0.061AB+0.023AC+0.018BC-0.47A2-0.33B2-0.44C2

对该模型进行显著性分析，结果见表3和表4。

表2 胶陀螺多糖超高压辅助提取响应面优化试验结果与分析

表3 回归方程方差分析表

注 ：“**”差异极显著(P<0.01)；“*”差异显著(P<0.05) ；“—”差异不显著。

表4 回归模型的可信度分析

根据表3和表4的分析结果可知，P<0.000 1，表明该模型极为显著，回归模型和实际值拟合度较好，试验操作的误差相对较小，所以，该方程可以代替实验的真实值，对试验结果进行细致分析。同时R2=98.19%，这表明，预测结果与测定结果保持着高度相关性，方程具有较高的可靠性，在回归模型中B、C、A2、B2、C2对响应值影响极显著。

2.2.3 各因素交互作用对胶陀螺多糖得率的影响 交互作用对胶陀螺多糖得率的响应面分析见图4。

图4 交互作用极显著因素响应面及等高线图

通过图4可以看出，各个试验因素的交互作用较为显著，各个因素对结果的影响权重分别为：保压时间(B)> 料液比(C)>超高压压力(A)。通过对回归模型方程进行求解，得到的胶陀螺多糖最佳的提取工艺为：保压时间为5 min、料液比1∶20 g/mL、超高压压力300 Mpa，此条件下多糖得率可达5.03%。试验测定值和理论值比较相近，说明此模型可优化胶陀螺多糖提取工艺参数。

3 结 论

本研究通过单因素试验和响应面分析法，对胶陀螺多糖提取工艺进行优化，对保压时间、料液比和超高压压力三个关键因素进行了研究。试验结果表明，在保压时间为5 min、料液比为1∶20 g/mL、超高压力为300 Mpa的条件下，多糖得率可以达到5.03%，这表明该回归方程较真实地反应出各因素对胶陀螺多糖提取得率的影响，试验测定值和理论值比较相近，能够说明此模型可优化胶陀螺多糖提取工艺参数。