基因成品分装与QC酶切检验生产工艺及分析

刘媛

【摘  要】介绍了在基因部里的每个小组送来的质粒送到我们的基因公共服务部，首先通过基因公共服务部里面要经过基因成品分装的测值、分装、装袋、提交的几个步骤，然后在通过提交的在进行QC酶切验证规范进行检测，一般只有通过QC的检测，才能将基因成品分装，重点叙述的是分装和QC检测的工艺流程、操作规程、注意的问题及事故处理，提出了在基因成品分装分装和QC酶切验证规范里面最重要的两个步骤是分装和酶切，这两个结果会直接影响产品能否满足所订单用户的要求。

【关键词】分装;装袋;酶切;QC检测

【中图分类号】R197      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2019）03-0279-02

引言

介绍由各个小组送到QC的质粒，先通过基因成品分装的顺序在由基因成品分装提交至QC的检测表，在进行后续的行程。

首先介绍一下分装的整体的流程：第一是先用Nandro分光光度计进行测值，在测的值中，必须保证质粒的浓度保持在80才可以进行分装，分装的一般分为4组和10组，偶尔会有20组的，分装时一般分两组，一个给订单用户，一个给QC进行检测是否通过可发，发出去的必须要放进旋转蒸发仪进行冻干，也有订单用户要求液体基因成品分装液体基因成品分装的也需要让所分的浓度保持在95到105的区间内;第二装袋;第三提交QC清单。

1 基因成品分装和QC酶切验证规范的生产状况

1.1质粒是什么

细菌、放线菌和真菌中;自主复制和转录;拷贝数恒定;表达遗传信息^[1]

1.1.3质粒的作用

使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等^[2]。

1.2基因成品分装的流程

1.2.1质粒定量

测值：把每个组发下来的质粒在分光光度计上面测值，浓度小于80的要放进旋转蒸发仪中，等到浓度到达80时我们才能进行分装。

遇到超出OD值范围，或提供质粒量过少的质粒，将其取出放到相应小组的质粒暂时存放区。发货工作结束后，统计上述发货不能通过的质粒，并伴随邮件归还相对应小组。

贴标签：将定量之后的质粒摆放整齐，并按照DNA量的要求摆放上相应数量的灭菌发货管。DNA量的要求4微克的拜访两个灭菌发货管;标签整洁的贴在发货管壁上（标签与管壁之间没有杂质和手印），贴过之后要首位对齐。

定量流程：

（1）接通Nanodrop2000电源，并关闭上臂。

（2）打开Nanodrop2000操作软件，选择Nucleic Acid项。

（3）调零：吸取2微升TE加到下臂小孔上，放下上臂，按下软件中的blank键。

（4）测量：用擦镜纸擦去上下臂的TE，吸取待测样品2微升，加至下臂测量孔上，放下上臂，按下软件中的Measure键，保存测试结果至本机合适目录。测量后，用擦镜纸擦拭上下臂2～3次，继续下一个样的测量。

（5）测量大量样品时，因每测60各左右，重新调零1次或者每一个小时重新调零一次。测量完毕后，因吸取ddH2O滴加到测量孔上，放下上臂，轻压几下，用擦镜纸擦去上下臂的液体。

1.2.2质粒分装

首先是贴完标签之后，仔细核对标签和质粒的一一对应关系，确保对应准确无误后，进行分装。按照多于DNA量要求的标准进行分装（以DNA量要求4微克，应分装质粒大于等于4.5微克）质粒逐个分装到对应的发货管中。一般情况下，同样的标签要求的发货管中分装的质粒量相同。

将分装对应的质粒发货管，经过再一次仔细的核对其标签之后，按照顺序抽取一管质粒，按照PUC系列红盖子和非PUC系列蓝盖子的原则对发货管封口。与信息表核对信息提交发货清单给QC组进行检测。

在对质粒进行分装时，如果是分在4组的话，用6000除以浓度;如果是分在10 组的话，用11000除以浓度;如果是分20组的话，用22000除以浓度。

1.2.3质粒送检、冻干和装袋

将分装有相应质粒发货管，经过再一次仔细的核对其标签之后，按照顺序分别抽取一管质粒，按照PUC系列红盖子和非PUC系列蓝盖子的原则对应發货管封口，信息表核对信息，进行检测。

装袋：从旋转蒸发仪中有序的取出质粒已经冻干的发货管，摆放到相应的位置;按照PUC系列红盖子和非PUC系列蓝盖子的原则对发货管封口;在灯光下仔细检查发货管中的质粒是否有含杂质;把发货管放到相对应的发货袋中，与信息表核对信息，有的要装穿刺，有的要装甘油，有的要装诱导剂。

1.3 QC酶切验证规范的流程

1.3.1抽质粒

由基因成品分装提交的清单进行抽取质粒已加TE的备份，在放水，水分为白水和蓝水（配水：{白水：拿1750微升的无菌水加入200微升CUTSMART.蓝水：拿1750微升的无菌水加入200微升和10乘140微升}拿到震荡仪震荡），对照每个质粒的载体大小和片段大小选不同水和加入什么酶进行酶切^{[5] [6] [7]}。对照检测表，偶尔会有SmalI验证^{[8] [9]}。

1.3.2酶切

在所选取的水中，首先加入质粒3微升（若是原始质粒并且浓度在100纳克/微升，加3微升;若浓度在200纳克/微升，加2微升;若浓度在300纳克/微升以上，加1微升），在对应清单加入相应的酶，酶的量是0.8微升。配好酶切体系，混匀（用手指轻弹几下，用离心机离心一下），37度水浴半小时，在检测表上记录酶切反应开始时间，及左右酶和编号，同时签名。

根据检测表上的要求，使用对应的酶来进行酶切实验：

质粒的量需要根据载体片段大小适当调整。

1.3.3点样

在点样之前都要做胶（做胶的方法是称取1.62克的琼脂糖，加入185毫升的TAE溶解，放入微波炉中高火加热20分钟，在10分钟，8分钟，6分钟，4分钟，2分钟，拿出来的时候都要进行震荡^[10]，最后倒入模具成型）。

1.3.4电泳

（1）上样量：质粒3微升，酶切产物6微升，Marker3微升。

（2）上样顺序：从左至右，质粒、酶切产物、Marker。如果有PCR产物，点样顺序为质粒、PCR产物、酶切产物、Marker。

1.3.5拍胶

在前面一个步骤做完，也就是跑完胶，就要来拍胶了。

有3000Marker的就要先拍，在拍完3000后再放进电泳槽里面继续跑KB，一般分3000则是在胶的三分之二出可拍，KB则是在胶的靠近边缘的时候拍。如图：

2 生物科技主要生产工艺的方法实验步骤

2.1 反应的机理

基因合成及相关分子生学服物务，多肽合成服务，蛋白表达和纯化服务，抗体服务和细胞系建立^[11]等服务，而每个环节都有不同的反映机理。基因公共服务的流程是这样的：

2.2.1载体信息

2.2生产流程叙述及其工艺分析

对于基因成品分装。在分装时一定不能出错，每个质粒对应的质粒的管子一定要一一对应，要是在这个不发出错的，后面的一系列的就会全错，所有在基因成品分装时一定要细心不能出错。

对于QC酶切验证规范，在酶切验证的时候也是重要的一个步骤，如若加错了酶会影响后面一个步骤-点样。每个酶对应的位点都是不一样的，所以在验证时一定要在酶切时注意加的酶的量和是否加错酶。

在普通的小基因的订单结束时候，同时需要准备ORF的订单。简单解释一下ORF克隆服务传统就是开放阅读框（ORF）克隆需要从RNA的提取，cDNA反转录和PCR克隆开始。这些步骤不仅花费您一定的科研经费，更花费您大量的宝贵时间。

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3 小结

（1）综述以上所有，基因工程技术使药品开发发生了根本性的转变。传统的药品开发方式是在大量的化学合成物质和微生物代謝产物中进行随机筛选，得到其中的有效成分作为新的药物。

（2）基因公共服务生产包括基因成品分装和QC酶切验证，这两个是相互影响的关系，在做这两个的同时一定要细心，仔细不能出错，否则会影响后面一系列的;

（3）在QC酶切验证的时候一定要等到一定的时间，才能拿产物，不然在点样时，会有酶切不完全，而且在酶切的整个过程中加酶的量一定要足，酶的加入量是0.8微升，不能加少了这样也会影响结果的;

（4）总的来说我们可以提出尽量加快分装的速度和酶切的速度，来让结果更早的出来，更早的可以基因成品分装给订单用户，但是在保证速度快的情况下，也更要保证你所做的事是对的，要做到“保质又保量”。

参考文献

[1]      孟祥平，杨建英，乔晓岚，席守民. 一种不依赖酶切位点的分子克隆方法[J]. 基因组学与应用生物学，2014，28（01）：163-167.

[2]      侯思名，刘凌云，殷旭东，岑晓江，王波，程在全. 药用野生稻BIBAC文库构建过程中质粒提取方法改进[J]. 西南农业学报，2014，11（01）：1-5.

[3]      姜超，张学文，潘映红. 蛋白质胶内酶切技术研究进展[J]. 生物技术通报，2015，15 （01）：61-66.

[4]      金科华，刘洁. 质粒抽提策略对双酶切鉴定的影响[J]. 山西医科大学学报，2015，42（06）：559-561.

[5]      马凯，胡红霞，于婧，周丹，孙艳，马磊，沈波. 双酶切和同源重组方法构建pMIR-reporter载体的比较[J]. 中国病原生物学杂志，2015，18（06）：495-499.

[6]      周思彤，王永胜，袁红霞，梁勤. 产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药质粒提取方法的研究和比较[J]. 中国卫生检验杂志，2015，28（13）：2099-2101.

[7]      刘沙. 基于模拟酶切vMIP-II的CCR1受体拮抗多肽的设计与生物活性研究[D].广东：暨南大学，2014.

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[9]      杜长城，弓维钧，黄俊轩，吕云，杨静慧，赵亚平. 质粒DNA提取与酶切方法的比较研究[J]. 天津：天津农业科学出版社，2006，30（04）：1-2.

[10]    程龙，周岩，丁丽华，叶棋浓. 琼脂糖凝胶的合适浓度对于回收酶切后质粒载体的重要性[J]. 生物技术通报，2008，42（03）：417-418.

[11]    Shalini S. Deb，Shamlan M.S. Reshamwala，Arvind M. Lali. A series of template plasmids for Escherichia coli genome engineering[J]. Journal of Microbiological Methods，2016， 28：452-458.