地高辛对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡作用的研究

吕雨晨 吴苗苗 房坤

[摘要] 目的 探討地高辛对体外培养的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响，并揭示其发生的可能机制。 方法 体外培养乳腺癌MDA-MB-231细胞，分为对照组和给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛）。CCK-8法检测不同浓度的地高辛、不同作用时间（24、48、72 h）对MDA-MB-231细胞活力的影响。流式细胞术定量考察不同浓度的地高辛对细胞凋亡的作用及对线粒体膜电位的影响。Western blot检测MDA-MB-231细胞中Bax、Bcl-2和P62、LC3B蛋白的表达情况。透射电镜观察不同浓度的地高辛对MDA-MB-231细胞自噬体产生的影响。 结果 CCK-8结果提示，与对照组比较，在不同时间点，给药组使MDA-MB-231细胞活力降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。Annexin V/PI双染结果提示，与对照组比较，给药组使细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。JC-1染色结果提示，与对照组比较，50、100、200 nmol/L地高辛使MDA-MB-231细胞线粒体膜电位电位降低，JC-1所占比例减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。透视射电镜结果提示，与对照组比较，给药组细胞形态发生凋亡样改变，给药组可见自噬体的形成。Western blot结果提示，与对照组比较，给药组上调促凋亡因子Bax，下调抗凋亡因子Bcl-2的表达，并上调自噬标志性蛋白LC3B表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;与对照组比较，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 地高辛抑制MDA-MB-321细胞的活力，促进凋亡，诱导自噬的发生，可能对三阴性乳腺癌有潜在作用。

[关键词] 三阴性乳腺癌;地高辛;凋亡;自噬;MDA-MB-231细胞

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）12（c）-0014-06

Effect of Digoxin on apoptosis of MDA-MB-231 cells in triple negative breast cancer

LYU Yuchen1   WU Miaomiao2   FANG Kun2   CHEN Wenxu1   SHEN Aizong2   LIU Tongzhu2   WANG Ning1

1.College of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Anhui Province， Hefei   230012， China; 2.Biomedical Engineering Agency， the First Affiliated Hospital of USTC  Anhui Provincial Hospital， Anhui Province， Hefei   230001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Digoxin on apoptosis of MDA-MB-231 cells of triple negative breast cancer in vitro， and to reveal its possible mechanism. Methods Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured in vitro and divided into control group and drug administration group （25， 50， 100， 200 nmol/L Digoxin）. CCK-8 method was used to detect the effects of Digoxin at different concentrations on the activity of MDA-MB-231 cells at different action time （24， 48， 72 h）. The effects of Digoxin at different concentrations on apoptosis and mitochondrial membrane potential were quantitatively investigated by flow cytometry. Expression of Bax， Bcl-2， P62 and LC3B in MDA-MB-231 cells was detected by Western blot. The effects of Digoxin at different concentrations on autophagosomes in MDA-MB-231 cells were observed by transmission electron microscopy. Results CCK-8 results indicated that， compared with the control group， the activity of MDA-MB-231 cells decreased in the drug administration group at different time， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Annexin V/PI double staining results indicated that compared with the control group， the apoptosis rate of the treated group increased with a statistically significant difference （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of JC-1 staining indicated that compared with the control group， 50， 100 and 200 nmol/L of Digoxin reduced the mitochondrial membrane potential of MDA-MB-231 cells， and the proportion of JC-1 decreased， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of fluoroscopy indicated that， compared with the control group， the cell morphology of the drug administration group underwent apoptotic changes， and the formation of autophagosomes was observed in the drug administration group. Western blot results indicated that， compared with the control group， the administration group up-regulated the expression of pro-apoptotic factor Bax， down-regulated the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2， and up-regulated the expression of autophagy marker protein LC3B， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）; compared with the control group， 50， 100 and 200 nmol/L of Digoxin decreased the expression of P62， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Digoxin inhibits the activity of MDA-MB-231 cells， promotes apoptosis， induces autophagy， and may have a potential effect on triple negative breast cancer.

[Key words] Triple negative breast cancer; Digoxin; Apoptosis; Autophagy; MDA-MB-231 cells

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一种侵袭性、转移性、复发性较强的恶性肿瘤[1]。目前，化疗是临床术后治疗TNBC的主要治疗手段，但其治愈率低，易产生耐药性[2]。因此，迫切需要寻求对TNBC治疗有效的药物。研究报道洋地黄类药物可有效抑制恶性肿瘤的生长及转移，促肿瘤细胞凋亡[3]。有研究证实自噬是洋地黄类药物治疗肿瘤的重要机制，其可诱导肿瘤细胞发生自噬性凋亡[4]。地高辛是临床上最常用的洋地黄类药物，且许多研究显示，其对多种恶性肿瘤均具有显著的抗肿瘤作用，可抑制细胞增殖，促进癌细胞自噬[5-6]。目前，已有研究报道地高辛可诱导肺癌发生自噬，促进肺癌的治疗[7]。然而，地高辛对人乳腺癌的作用机制尚不清楚，本研究选用乳腺癌MDA-MB-231细胞株作为研究对象，研究地高辛对乳腺癌凋亡作用的影响，为三阴性乳腺癌临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株与主要仪器  MDA-MB-231细胞株来源于中国科学院上海细胞库;SpectraMax？誖Ⅰ3全波长酶标仪（美国MD公司）;A00-1-1102型流式细胞仪（Beckman Coulter 公司）;HF型二氧化碳培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）;DMI3000B倒置顯微镜（德国莱卡公司）。

1.1.2 主要试剂  地高辛（纯度≥98%）（MCE公司，货号：HY-B1049）;DMEM高糖（美国Hyclone公司，批号：SH30022.01）;胰酶细胞消化液（碧云天生物技术研究所，货号：C0201）;胎牛血清（fatal bovine serum，FBS杭州四季青生物工程有限公司，批号：11012-8611）;CCK-8细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒（上海贝博生物有限公司，批号：BB4202-3）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物有限公司，批号：BB4101-3）;细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA604）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（杭州四季青生物工程有限公司，批号：P0010S）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  将MDA-MB-231细胞培养于培养基中（含10%胎牛血清），置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性  取对数生长期细胞，将密度为1×104个/mL，每孔100 μL，接种于96孔板中，设置5个复孔培养至细胞贴壁。实验分为空白组、对照组及给药组，空白组在不含细胞的培养基中加入CCK-8，对照组在含细胞的培养基中加入CCK-8，给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛），进行给药孵育24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育，在30 min、1 h、2 h、3 h、4 h时间点，测定各孔在450 nm的吸光度值（OD）。按照下列公式计算细胞生长活力：细胞活力% =[（OD给药组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）]×100%。

1.2.3 Annexin V-FITCH和PI双染检测细胞凋亡率  取对数生长期细胞，接种于6孔板，每板1×105个，对照组不做处理，给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231细胞24 h后，收取细胞。用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤2次，取3×105个细胞加入500 μL 1×结合液重悬细胞，加入5 μL FITC混匀，避光孵育15 min，再加入10 μL PI混匀，置于常温避光孵育5 min，用流式细胞仪进行检测各组凋亡率。

1.2.4 JC-1染色检测细胞线粒体膜电位  取对数生长期细胞，接种于6孔板，每板1×105个，对照组不做处理，给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231细胞24 h后，收集细胞用冷PBS洗涤2次。取2×105个细胞加入400 μL 1× JC-1工作液混匀，在37℃中孵育20 min，用1× Incubation Buffer清洗后，再加入400 μL 1× Incubation Buffer充分混匀，使用流式细胞仪进行检测。

1.2.5透射电镜观察凋亡体和自噬体的形成  取对数生长期细胞，接种于6孔板，每板1×105个，对照组不做处理，给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231细胞24 h后，收集细胞用PBS清洗后，离心收集细胞，缓慢加入1.5 mL电镜固定液固定，再用1%锇酸固定1.5 h，PBS清洗，在不同浓度的乙醇中进行逐级脱水，将脱水后的样品 渗透Spurr树脂中，在放入聚合器中聚合，将聚合后的样品在显微镜下包埋切片。用乙酸铀酰-柠檬酸铅双重染色，自然干燥后透射电子显微镜下观察自噬小体的形态。

1.2.6 Western blot检测MDA-MB-231细胞中Bax、Bcl-2、P62和LC3B蛋白表达水平  取对数生长期细胞，接种于6孔板，每板1×105个，对照组不做处理，给药组（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231细胞24 h后，收集细胞PBS清洗后，细胞裂解液裂解细胞，BCA试剂盒检测样品蛋白浓度，采用湿转转膜法，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉水溶液封闭2 h，将膜放入相应一抗HIF-1α、Bax、Bcl-2、P62和LC3B（1∶1000）和GAPDH（1∶5000），4℃孵育过夜，用PBST洗膜3次，放入HRP标记的二抗（1∶10 000）。室温孵育1 h后，显影，扫描曝光，用Image J软件分析，并计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。

1.3統计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地高辛对MDA-MB-231细胞活力的影响

2.2 地高辛对MDA-MB-231细胞促凋亡的作用

与对照组比较，给药组使细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。与对照组比较，50、100、200 nmol/L地高辛使MDA-MB-231细胞线粒体膜电位电位降低，JC-1所占比例减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图3。与对照组比较，给药组细胞形态发生改变，核内染色边缘化聚集，细胞核空泡变性，线粒体变性坏死，出现凋亡小体及坏死性细胞。见图4。与对照组比较，给药组上调MDA-MB-231细胞中促凋亡因子Bax的表达，下调抗凋亡因子Bcl-2的表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图5。

2.3地高辛诱导MDA-MB-231细胞自噬的发生

与对照组比较，给药组MDA-MB-231细胞内出现自噬囊泡双层膜结构。见图7。与对照组比较，给药组使细胞自噬因子LC3B表达上升，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;与对照组比较，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图8。

3 讨论

研究提示洋地黄类药物通过调节凋亡、自噬等途径抑制肿瘤细胞增殖、血管生成及转移[8-9]，洋地黄类药物靶向作用于肿瘤细胞的多种信号通路，具有潜在的抗肿瘤特性[10-11]。目前已有两种洋地黄类药物，分别为夹竹桃植物提取物Anvirzel和PBI-02504（Oleandrin）因其良好的抗肿瘤效果在美国通过Ⅰ期临床实验[12-13]。本研究将不同浓度地高辛在不同时间点作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞，研究发现，不同浓度地高辛在不同时间点可使MDA-MB-231细胞活力下降。

在肿瘤细胞中，凋亡被认为是癌症治疗的一种重要机制[14]。细胞凋亡主要阶段性标志是细胞核形态的变化，如细胞核膜整体损伤及凋亡小体的形成[15]。为证实细胞凋亡的激活，通过透射电镜观察及流式细胞术检测，与对照组比较，给药组细胞核内染色边缘化聚集，细胞核核内胞浆出现空泡变性，线粒体变性坏死，出现凋亡小体及坏死性细胞，进一步运用流式细胞术研究，结果提示，与对照组比较，细胞凋亡率增加。除此之外;细胞凋亡受多种促凋亡和抗凋亡因子的控制，抗凋亡和促凋亡蛋白Bax和Bcl-2是细胞凋亡的主要调节因子[16]，进一步确认细胞凋亡的基础过程，研究地高辛处理的细胞中Bax和Bcl-2蛋白变化，Western-Blot结果提示，与对照组比较，不同浓度地高辛可上调MDA-MB-231细胞中促凋亡因子Bax的表达，下调抗凋亡因子Bcl-2的表达。同时，凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2是介导调节线粒体膜电位的关键因子，维持线粒体膜的完整性和通透性[17]。在癌细胞中，Bcl-2蛋白高表达对诱导的细胞凋亡具有抑制作用，而促凋亡蛋白Bax在凋亡细胞刺激的激活下，导致线粒体膜电位通透性的损伤破坏，线粒体膜电位的降低，是诱导细胞凋亡的方式之一[18]。利用JC-1染色检测细胞线粒体膜电位的变化，结果提示与对照组比较，给药组线粒体膜电位逐渐降低，以上结果显示地高辛调节凋亡蛋白的表达，同时又破坏线粒体膜电位，诱导MDA-MB-231细胞的凋亡。

研究提示，自噬是一种细胞死亡机制，对各种癌细胞具有抗癌疗法的反应[19-20]，自噬可能成为治疗乳腺癌的有效途径。在自噬过程中，LC3B和P62参与自噬体的形成，随着自噬的进展，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ分布并积聚在自噬体的膜上，揭示了自噬状态，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ一般用于评估自噬过程，作为自噬的早期标志物[21]。P62作为一种传统的自噬受体，结合LC3B选择性地渗入自噬体并在自噬过程中降解，P62表达减少，激活自噬;P62缺失导致LC3-Ⅱ形成[22]。本研究提示与对照组比较，给药组细胞自噬因子LC3B表达上升，LC3-Ⅱ的表达水平均升高， 同时，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表达下降，细胞的自噬活性增加。在透视电镜下观察，与对照组比较，给药组形态变化，细胞内出现双层膜的自噬体结构，内含待降解物的单层膜自噬溶酶体结构。提示地高辛诱导MDA-MB-231细胞自噬的产生。

综上所述，地高辛调节凋亡蛋白的改变，损伤线粒体膜电位，抑制癌细胞的活力，促进其凋亡，并诱导自噬的发生，发挥抗肿瘤的作用。

[参考文献]

[1]  Hu S，Xu Y，Meng L，et al. Curcumin inhibits proliferation and promotes apoptosis of breast cancer cells [J]. Exp Ther Med，2018，16（2）：1266-1272.

[2]  Rida P，Ogden A，Ellis IO，et al. First international TNBC conference meeting report[J]. Breast Cancer Res Treat，2018， 169（3）：407-412.

[3]  Winnicka K，Bielawski K，Bielawska A，et al. Antiproliferative activity of derivatives of ouabain， digoxin and proscillaridin A in human MCF-7and MDA-MB-231 breast cancer cells [J]. Biol Pharm Bull，2008，31（6）：1131-1140.