肺炎支原体黏附细胞器的结构与功能

倪珊珊,薛冠华,李少丽,闫 超,孙红妹

肺炎支原体是柔膜体纲的一种非典型病原体,是社区获得性肺炎的重要致病原。肺炎支原体对宿主细胞的黏附是其致病的前提条件。肺炎支原体在通过飞沫传染侵入呼吸道后,借助黏附细胞器(attchment organelle)牢固黏附于呼吸道上皮细胞的表面受体。黏附细胞器又被称为尖端结构(tip structure)或末端细胞器(terminal organelle),可分为表面结构和内部结构两部分。其中,内部结构分为半透明区和核心结构,而核心结构又分为终端按钮(terminal button)、成对板(paired plates)、碗状/轮状复合体(bowl/wheel complex)[1]。

根据单克隆抗体和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)可以确定黏附细胞器15个组成蛋白质的定位[2],如图1所示[1]。

图1 肺炎支原体黏附细胞器结构示意图[1]Fig.1 Schematic diagram of M.pneumoniae attachment organelle

1 表面结构

表面结构负责肺炎支原体与宿主细胞表面的结合,包括P1黏附素、P30黏附素、P40蛋白、P90蛋白[1]。

1.1 P1黏附素(MPN141) P1黏附素由1 627个氨基酸残基组成,大小为176kDa,是一个可溶性蛋白质[2]。加工后,其长度缩短到1 568个氨基酸残基,大小为170kDa。

P1黏附素的作用包括两方面:一方面参与肺炎支原体与细胞表面受体的结合,另一方面参与肺炎支原体在细胞表面的滑动[1]。P1二聚体与P90二聚体形成异源二聚体复合物,即P1黏附复合体。后者被认为是滑动机制的支柱,因为支原体的滑动速度在P1黏附蛋白单克隆抗体存在时降低。

1.2 P30黏附素(MPN453) P30黏附素由274个氨基酸残基组成,大小为30kDa,是一种膜结合蛋白,可分为4个结构域——前导肽区、胞内段(结构域I)、跨膜区及胞外区(包括结构域II和结构域III)。

Chang HY等[3]构建了缺失P30不同结构域的多个肺炎支原体转化株以比对P30各个片段的功能,结果显示,结构域II的缺失、结构域III的受损以及跨膜区特定部位氨基酸的突变严重影响了蛋白的稳定性和功能。细胞质内结构域I的缺失虽然不影响P30的稳定性、定位能力及P65的稳定性,但其黏附能力仍然很差。这些缺失还影响了信号肽的形成过程。Marotta和Nicole[4]发现P30胞外区有一串富脯氨酸重复序列(PRRs),该序列的改变降低P30的稳定性以及肺炎支原体的滑动速度。

Chang HY等[5]发现P30翻译后修饰的信号肽切割部位可能在52-53氨基酸位点之间。翻译后修饰缺陷株的滑行速率和黏附能力均下降,提示翻译后修饰对形成有功能的成熟P30黏附素是必要的,推测翻译后修饰引发了胞外结构域的构象改变或使得胞内结构域中某一结合位点暴露,最终促成P30黏附素与受体的结合。

Layh-Schmitt G等[6]进行化学交联的研究表明,P30黏附素和P1黏附素之间距离很接近,这使P30与P1在致病方面表现出相似的功能和协同作用。Krause DC等[7]发现P30基因的突变导致尖端结构上P1黏附复合体的密度降低,说明P30是P1黏附复合体的辅助蛋白。

Hasselbring BM等[8]发现P30突变株(II-3R)的第2个移码突变导致P30黏附素改变,导致肺炎支原体具有黏附功能却不具备移动功能。以上实验说明P30黏附素在肺炎支原体的滑动和黏附上起作用。

1.3 P40(MPN142) P40由454个氨基酸残基组成,大小为48kDa,是一种可溶性蛋白。P40由MPN142蛋白上的6个肽段分割而成,氨基酸序列范围是43-397。其信号序列具有一部分N端跨膜结构域[9]。

P40基因的非同义突变导致尖端结构表面P1黏附复合体数量下降,说明P40是P1黏附复合体的辅助蛋白。P1蛋白插入细胞膜的过程很大程度依赖于P40[8]。

1.4 P90(MPN142) P90由764个氨基酸残基组成,83kDa,也是一种可溶性蛋白。P90由MPN142蛋白上的15个肽段分割而成,氨基酸序列范围是456-1158。其信号序列具有一部分N端跨膜结构域。P90二聚体与P1二聚体形成异源二聚体复合物,即P1黏附复合体[9]。

2 内部结构

内部结构分为半透明区和核心结构,其作用包括细胞器的形成、维持以及力的产生和传递。半透明区被刚性、不扩散的电子透明物质占据,作用是将碗状/轮状复合体产生的力传递至成对板[10]。核心结构在断层图像中也被称为“电子致密核”,因为与细胞的其他部分相比,它具有较高的电子密度。核心结构可进一步分为3个部分:终端按钮、成对板和碗状/轮状复合体。

2.1 终端按钮(terminal button) 终端按钮由HMW3和P65蛋白构成,参与确定肺炎支原体的滑动方向的改变。

2.1.1 HMW3(MPN452) HMW3由672个氨基酸残基组成,大小为74kDa,是一种骨架蛋白。HMW3具有2个大的酸性富脯氨酸结构域(APR)。

HMW 3浓度相对丰富,似乎以聚合丝的形式存在,围绕着核心结构的近胞膜侧。

HMW 3的丢失伴随着p65水平的降低,显著影响尖端结构功能,造成细胞黏附性差、肺炎支原体失去滑动能力以及P1黏附素在尖端结构的定位改变。Krause DC等[7]认为终端按钮在缺少HMW3的情况下会不断改变亚结构或失去亚结构。在没有HMW 3的情况下,野生型肺炎支原体的核心结构在复制后从终端按钮分离的过程似乎也受到了损害[10]。这些观察表明,HMW 3在尖端结构组装和功能中起到空间组织作用。

2.1.2 P65(MPN309) P65蛋白由405个氨基酸残基组成,大小为47kDa,其氨基酸序列的特点是存在两个长度为40个氨基酸残基的重复区,分别位于第57～96氨基酸残基和第122～161氨基酸残基。P65形成一个由直径30 nm的中心球和由约10 nm凸出细丝组成的多聚体[11]。

HasselbringBM等[12]发现P65蛋白与P30蛋白在黏附复合体形成的过程中几乎同时移动。在采用转座子插入而构建的P65蛋白功能缺失的突变株中,P30的稳定性下降。将p65突变株进行回补后,P65和P30的稳定性都得到了恢复。考虑到P30和P65之间密切的空间和功能关系,P65可能与P30内部结构域有交互作用。终端按钮与膜前侧的紧密结合可以通过这种相互作用来实现。此外,P65还可以通过修改附着器相对于细胞轴角度确定滑动方向。

2.2 成对板(paired plates) 成对板由间隔7 nm的成对分隔板组成,即薄板和厚板。薄板的特色是具备一个规律的六角形晶格排列,可能由HMW1和CpsG组成。厚板长轴具有间隔为8 nm的条纹结构[10]。成对板可能作为附着器形成的支架,在滑动中发挥关键作用[1]。

2.2.1 HMW1(MPN447) HMW1由1 018个氨基酸残基组成,大小为112kDa,是一种骨架蛋白。其氨基酸序列可被分为3个结构:N端的170个氨基酸残基组成具有丰富芳香族氨基酸残基和甘氨酸残基(EAGR)的模体;中间171～522残基部分是富含酸性氨基酸和脯氨酸(APR)的区域;C端的523～1018残基以两个卷曲螺旋区为特点。EAGR模体和卷曲螺旋可能参与薄板的六角形晶格排列的形成,因为他们与其他蛋白有交互作用[13]。

Seto等[14]报道,HMW1或HMW2的非同义突变导致电镜图中没有电子密度核。荧光融合蛋白的显微镜观测显示HMW1定位在成对板的中心部分,暗示薄板包含 HMW1[2]。Krause DC等[15]认为,HMW1作为黏附细胞器的一个早期装配蛋白,对于黏附细胞器其他蛋白的稳定和定位、以及黏附细胞器的形成、黏附和移动很重要。HMW1与HMW2的稳定性是相互依赖的。Page CA和Krause DC等[16]研究发现HMW1蛋白通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶被磷酸化,HMW1缺失突变株M6的P1蛋白磷酸化水平上升,出现截短的P30蛋白。

2.2.2 HMW2(MPN310) HMW2由1 818个氨基酸残基组成,大小为216kDa,是厚板一种特异的骨架蛋白[2]。

HMW2的N端和C端分布定位在成对板的前后端。其氨基酸序列中由1 257个残基组成的11个卷曲螺旋区域[17]构成厚板的条纹,因为厚板的条纹数目范围在10～12条之间。

HMW2的丢失或截断会影响蛋白质HMW 1、HMW 3、P65、P41、P30和P24的合成或稳定性。这很可能是HMW2突变菌株在X线断层影像中缺少核心结构的原因。

HMW2与HMW1的稳定性存在一定关联。

2.2.3 CpsG(MPN066) CpsG 位于薄板,由544个氨基酸残基组成,大小为63kDa。它具有321个肽段,等电点为8。CpsG蛋白是manB基因编码的一种磷酸甘露糖变位酶,可将α-D-甘露糖-1-磷酸转化为D-甘露糖-6-磷酸。该酶具有1个活性部位和4个离子结合位点,其辅因子为Mg2＋。Li P[18]等在野生型沙门氏菌和减毒的ΔcyaΔcrp疫苗株中引入了(Δcpsg)缺失突变。突变株出现糖类合成的缺陷,导致其毒力减弱。口服接种突变株的小鼠比其亲本菌株诱导的小鼠抗鼠伤寒血清IgG水平更高。口服接种突变株的小鼠完全免受野生型鼠伤寒沙门菌的攻击,部分免受野生型肠炎沙门氏菌的攻击。这些结果表明,Cpsg的缺失在疫苗制备上是有用的突变,可以进一步应用在肺炎支原体的预防研究上。

2.3 碗状/轮状复合体(bowl/wheel complex) 碗状/轮状复合体由P24、P41、P200、TopJ、Lon、MPN387组成,连接黏附细胞器和肺炎支原体的其余部分,可能负责力的产生或传递。

2.3.1 P24(MPN312) P24由218个氨基酸残基组成,大小为24kDa。

Hasselbring BM等[19]应用P30-cyan荧光蛋白(CFP)和相位对比度/荧光显微镜观察野生型肺炎支原体尖端结构的两极和侧面,发现大部分P24与P30配对。在没有P24的情况下,未与P30配对的P41数目减少两倍,肺炎支原体滑行频率的降低和尖端结构的形成降低是相似的,因此推测预先定位的P24(即与现有的尖端结构相关联)可以促进P41在新尖端结构形成中的初始凝聚,P24在尖端结构组装过程中起着守门人的作用。

此外,单独增添P24并不足以使突变型肺炎支原体的滑动频率恢复到野生型肺炎支原体水平,说明P24功能依赖P41。当缺乏P41时,P24呈现一个动态定位的模式。这说明P24需要P41来定位在尖端细胞器上。P24在细胞分裂时段初始尖端结构装配的亦始起作用,还用于调节滑动马达的活动。

2.3.2 P41(MPN311) P41由357个氨基酸残基组成,大小为41kDa,属于细胞骨架蛋白,与肺炎支原体的滑行有关。

P41突变菌株滑动速度和频率仅为野生株水平的10%～30%。

P41突变菌株缺乏轮状/碗状复合体,呈现黏附细胞器与菌体分离的表型,这表明P41在轮状/碗状复合体的装配和稳定上是必需的。

新生黏附细胞器合适的空间定位也需要P41蛋白。P41使新生黏附细胞器在已存在的结构附近生成。P41在装配过程起到的空间定位作用,可能通过至少两个机制完成。首先,P41可能识别并结合已存在尖端细胞器的一个蛋白成分。其次,模式原核生物中有越来越多的证据表明,细菌染色体具有更高的有序结构,即起点和末端始终位于细胞内的特定位置。因此支原体染色体可能为P41结合以及黏附细胞器的正确定位提供框架,从而使黏附细胞器的功能与细胞分裂协同。

此外,P41还可以稳定P28蛋白[20]。

2.3.3 P200(MPN567) P200由1 036个氨基酸残基组成,大小为117kDa,包含酸性、富含辅氨酸的结构域,具有6个EAGR盒(富含芳香和甘氨酸残留物),后者是与肺炎支原体紧密相关的生殖支原体中的蛋白质相互作用结构域,可能介导装配高级复合体。

P200突变的肺炎支原体黏附水平与野生株一致,但滑动速度下降[2]。这说明P200在肺炎支原体的滑动上起作用。Jordan JL等[21]也认为,P200对于M129的滑动速度和频率是必需的,对于黏附是非必需的。

Feng M等[22]通过研究运动相关蛋白发现,只有P200随着培养时间延长,稳态水平下降。P200在接种后72 h后稳态水平下降。他们认为P200的丢失可能与细胞成熟有关。

2.3.4 TopJ(MPN119) TopJ由910个氨基酸残基组成,大小为100kDa。它具有一个J-结构域、2个黏附细胞器特有的结构域:富含酸性氨基酸和脯氨酸结构域(APR)和C端结构域。学者Cloward和Krause[22]通过对TopJΔAPR、TopJΔC突变株的免疫荧光电镜观察,发现富含酸性氨基酸和脯氨酸结构域(APR)和C端结构域是TopJ定位到黏附细胞器的关键。因为J结构域可以促进肽的结合以及蛋白正确装配,因此可认为TopJ是一种促进黏附细胞器成熟的分子伴侣。Feng M[23]认为TopJ在黏附细胞器组装后期起作用。另外,当Top J缺失,P1会呈现为异常的、抗胰蛋白酶的构象,影响肺炎支原体的黏附能力,可认为TopJ影响肺炎支原体的黏附功能。

2.3.5 Lon(MPN332) Lon由795个氨基酸残基组成,大小为90kDa。Lon蛋白是一种可溶性蛋白,共有548肽段,被标注为ATP依赖的丝氨酸蛋白酶,以双链、位点特异性的方式与DNA结合。Lon可将被tmRNA标记的突变蛋白、异常蛋白质以及特定短期调节蛋白选择性降解为5-10个氨基酸的短肽片段,在维持细胞稳态上起重要作用,可使细胞从应激产生的DNA损伤和发育改变中存活,故可被热休克诱导表达[24]。

2.3.6 MPN387 MPN387由358个氨基酸残基组成,大小为43kDa,是一种可溶性蛋白。2个MPN387通过卷曲螺旋的相互作用形成平行的同型二聚体,呈哑铃形,长42.7 nm、直径9.1 nm,包括一个长24.5 nm的中心平行卷曲螺旋部分。

MPN387在力的产生是必要的,在黏附上是非必需的[2]。产生自碗状复合体的力可能通过MPN387传播至成对板。

MPN387突变株黏附功能保留,但黏附细胞器的一些成分蛋白量减少,这说明MPN387还具有其他未知的功能[25]。

3 结 论

迄今为止,支原体学家通过人工构建各种蛋白缺陷型的肺炎支原体突变株,并结合免疫荧光电镜、断层摄影等技术,对肺炎支原体黏附细胞器及其成分蛋白的结构与功能有了初步的了解,为肺炎支原体感染的检测、治疗、预防相关研究提供基础。例如,CpsG蛋白在伤寒沙门菌的免疫预防上有作用,或许有助于抑制肺炎支原体感染。Lon蛋白在维持肺炎支原体稳态方面起到重要作用,破坏其结构能否有助于人体清除肺炎支原体?黏附细胞器表面蛋白的免疫原性与抗原性如何,是否可以应用在血清学检测与疫苗制备上?当然,肺炎支原体黏附细胞器还有很多未解之谜。蛋白水平上,黏附细胞器蛋白的合成、运输以及能量代谢过程、各蛋白之间相互作用尚未研究透彻;肺炎支原体黏附细胞器的成分蛋白各自参与了哪些信号通路,是否具有潜在的促炎活性,激活机体体液免疫、细胞免疫?细胞水平上,黏附细胞器在肺炎支原体内的装配过程、黏附细胞器上的P1黏附复合体与人体呼吸道黏膜上皮细胞哪类受体结合、这一过程依赖什么供能、P1黏附复合体存在怎样的构象改变均不清楚。对上述科学问题的进一步探索将有助于认识肺炎支原体,并改善肺炎支原体感染的检测、治疗及预防水平。

利益冲突:无

引用本文格式:倪珊珊,薛冠华,李少丽,等.肺炎支原体黏附细胞器的结构与功能[J].中国人兽共患病学报,2019,35(9):831-836.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.097