一测多评法测定番石榴叶中6种黄酮类成分的含量
2019-10-11熊素琴燕娜娜陈鸿平刘友平
方 皓，熊素琴，燕娜娜，陈 林，陈鸿平，刘友平
成都中医药大学药学院 中药材质量标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，成都 611137
番石榴叶为桃金娘科番石榴属乔木番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的叶，具有涩肠止泻、收敛止血的功效，用于治疗泄泻，下痢不止，湿疹骚痒，跌打损伤，创伤出血[1]。现代药理研究表明，番石榴叶中含有的黄酮类、酚类、萜烯、三萜类等化学成分具有抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用[2-6]。
一测多评法是利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只以一个对照品为参照物(对照品廉价、稳定、易得)，实现多个成分(对照品相对价高难得)的同步测定，这是一种中药多成分同步质量控制的新模式[7]。
黄酮类化合物作为番石榴叶的主要活性成分，现有番石榴叶药材质量标准中并未对其黄酮类成分含量进行测定，导致药材质量难以控制。虽然也文献报道番石榴叶中多种黄酮类成分同时测定的方法[8，9]，但需要购买多个对照品，且操作繁琐，在实际质量控制中难以广泛普及与应用。本实验通过一测多评法(QAMS)同时测定番石榴叶中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，旨在为番石榴叶药材质量控制与评价提供新方法。
1 材料
1.1 仪器
1260AT 型高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司)；HPLC-20AT 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BN3000 型万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；CP2000 型十万分子一电子天平(德国 Sartorius 公司)；UPTUO-I-1000TE 优普系列超纯水机(成都纯水科技有限公司)；SG8200HDT 型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)。
1.2 材料
金丝桃苷(批号：wkq18111901)、异槲皮苷(批号：wkq18022308)、瑞诺苷(批号：PS000436)、番石榴苷(批号：wkq18111404)、萹蓄苷(批号：PS000159)、槲皮素(批号：wkq18030806)，纯度均为HPLC≧98%，所有对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，美国TEDIA有限公司)；甲醇、无水乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。
1.3 药材
11批番石榴叶药材购自成都通灵中药饮片精选有限公司，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为桃金娘科番石榴属植物番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的叶，样品信息见表1。
表1 样品信息
2 方法与结果
2.1 测定方法的建立
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18% A；40～65 min，18%～49% A；65～70 min，49%～11% A)；检测波长：360 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃。
2.1.2 对照品溶液的制备
分别取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素浓度分别为1.172、1.121、1.093、1.102、1.188、1.154 mg/mL的对照品储备溶液，依次精密吸取各对照品储备溶液150、100、150、150、200、200 μL，置同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
取本品粉末(过4号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用60%乙醇补足减少质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别精密吸取上述混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，结果见图1。
2.1.4 线性关系考察
取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液1、3、7、10、15、20 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，每个浓度进样3次，取平均值。以对照品进样量(X) 为横坐标，峰面积(Y) 为纵坐标，进行线性回归，结果表明各化合物在相应范围内线性关系良好(见表 2)。
图1 混合对照品(A)、番石榴叶样品(B)及阴性对照(C)的HPLC图谱Fig.1 HPLC of reference substances(A),Psidium guajava sample(B) and negative control(C) 注：1.金丝桃苷；2.异槲皮苷；3 .瑞诺苷；4.番石榴苷；5.萹蓄苷；6.槲皮素。Note:1.Hyperoside;2.Isoquercitroside;3.Reynoutrin;4.Guaijaverin;5.Avicularin;6.Taxifolin.
表2 6种黄酮类成分线性关系考察
2.1.5 相对校正因子计算
以金丝桃苷为内参物，精密吸取混合对照品溶液1、3、5、7、10、15、20 μL，进行分析，记录各成分峰面积，计算金丝桃苷对异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的相对校正因子，结果见表3。
表3 相对校正因子测定结果
续表3(Continued Tab.3)
进样量Sample volume(μL)f金丝桃苷/异槲皮素Hyperin/Isoq-uercitrosidef金丝桃苷/瑞诺苷Hyperin/Reynoutrinf金丝桃苷/番石榴苷Hyperin/Guaijaverinf金丝桃苷/萹蓄苷Hyperin/Avicularinf金丝桃苷/槲皮素Hyperin/Taxifolin150.937 90.865 30.859 40.899 90.609 8200.937 10.864 20.858 20.898 50.609 1平均值Average0.937 20.865 10.858 60.899 60.611 4RSD(%)0.040.080.070.070.45
2.1.6 精密度试验
取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录各成分峰面积并计算得到金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为1.10%、1.13%、1.12%、1.12%、1.12%、1.10%，表明仪器精密度良好。
2.1.7 重复性试验
取Y1样品按“2.1.3”项下方法制备6份供试品溶液，进样分析，结果金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为0.97% 、0.90%、0.79%、0.87%、0.82%、1.58%，表明该方法重复性良好。
2.1.8 稳定性试验
取“2.1.3”项中供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、36 h进样分析，记录各成分峰面积并计算得到金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面积RSD 值分别为0.26%、0.30%、0.41%、0.32%、0.35%、0.64%，表明供试品溶液在36 h 内稳定性良好。
2.1.9 加样回收率试验
取同一批已知6种成分含量的番石榴叶供试品粉末约0.5 g，精密称定，平行6份，加入各对照品储备液适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，结果见表4。计算得到金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的平均加样回收率依次为102.34%、102.39%、101.05%、100.12%、101.11%、99.01%，RSD值依次为2.13%、1.11%、3.06%、3.32%、2.00%、3.44%，表明该方法加样回收率良好。
表4 番石榴叶中6种黄酮类成分的加样回收率(n=6)
续表4(Continued Tab.4)
化学成分Component取样量Sample amout(g)样品中量Sample content(mg)加入量Added (mg)测得量Measured (mg)回收率Recovery(%)平均回收率Average recovery(%)RSD(%)0.500 20.485 20.546 51.049 8103.310.505 20.490 00.546 51.061 1104.490.500 80.485 80.546 51.014 796.79番石榴苷Guaijaverin0.500 71.151 61.212 22.325 496.83100.123.320.504 41.160 11.212 22.332 296.690.500 61.151 41.212 22.412 0103.990.500 21.150 51.212 22.341 598.260.505 21.162 01.212 22.389 3101.250.500 81.151 81.212 22.408 7103.69萹蓄苷Avicularin0.500 71.301 81.425 62.787 6104.22101.112.000.504 41.311 41.425 62.768 9102.240.500 61.301 61.425 62.721 099.570.500 21.300 51.425 62.733 5100.510.505 21.313 51.425 62.761 5101.570.500 81.302 11.425 62.707 198.55槲皮素Taxifolin0.500 70.055 10.057 70.113 2100.7599.013.440.504 40.055 50.057 70.112 799.230.500 60.055 10.057 70.114 7103.420.500 20.055 00.057 70.112 8100.110.505 20.055 60.057 70.111 697.020.500 80.055 10.057 70.109 093.50
2.2 相对校正因子重现性考察
考察不同色谱系统(岛津HPLC-20AT 型和两台Agilent 1260AT 型)及不同的色谱柱：Boston C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)对相对校正因子的影响，相对校正因子RSD<2.7% ，说明相对校正因子在不同色谱柱和仪器下的耐用性较好，结果见表5。
表5 不同色谱柱和仪器测得的相对校正因子
2.3 QAMS法对待测色谱峰的定位
通过相对保留时间对待测化合物进行指认。以金丝桃苷为参照，分别考察相对保留时间在不同色谱系统和不同色谱柱中的重现性。各待测组分相对保留时间无明显差异，RSD值均小于5%，可以用来进行色谱峰的定位，结果见表6。
表6 不同仪器及规格色谱柱下目标成分的相对保留值
2.4 QAMS法与外标法测定结果的比较
取 11 批番石榴叶样品粉末，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液，进行分析，采用外标法测定样品中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，再用建立的QAMS法对其进行计算，结果表明，2种方法测得的番石榴叶中有效成分含量没有显著性差异，提示“一测多评”法应用于番石榴叶的多成分质量评价是可行的。结果见表7。
表7 外标法与QAMS法测定番石榴叶中黄酮类成分含量的比较(n=3)
注:a:外标法；b:QAMS。
Note:a:external standard method;b:quantitative analysis of multi-components by single marker.
3 讨论
3.1 供试品制备条件考察
分别考察了不同提取方式(回流、超声)、提取溶剂(纯甲醇、70%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇)、溶剂用量(15、25、50 mL)、提取时间(30、40、50 min)对番石榴叶中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的提取效率的影响，最终确定提取条件为以60%乙醇25 mL超声提取30 min，6种黄酮类成分提取率较高，且色谱峰峰形较好，分离度较好。
3.2 流动相及检测波长的选择
本实验考察了甲醇、乙腈分别与0.2%磷酸水、0.1%甲酸水作为流动相时的分离效果和出峰时间，最终选择乙腈-0.2%磷酸水为流动相，梯度洗脱，得到的色谱图中各色谱峰出峰时间适中，分离效果较好。参考紫外可见分光光度法，在 200～400 nm 下对 6种对照品进行了扫描，结果表明在360 nm处各色谱峰分离效果好，且均有最大吸收，故选择360 nm为检测波长。本次实验中，流动相条件对色谱峰峰形及分离度的影响大于提取方式和提取溶剂。
3.3 内参物的选择
本实验选择金丝桃苷为内参物，金丝桃苷价格低廉，理化性质稳定，且实验过程中长期放置后峰面积没有明显变化，因此选择金丝桃苷对番石榴叶中5种黄酮类成分进行测定。
3.4 测定结果分析
来自11个不同地区的番石榴叶饮片中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量平均值分别为0.201%、0.229%、0.084%、0.226%、0.217%、0.015%。傅予[10]在乙醇体积分数51.62%、乙醇用量25 mL、酶用量0.93%超声提取33.67 min条件下测定的总黄酮含量为98.43 mg/g，即百分含量为0.984%。本次实验中，选择60%乙醇25 mL超声提取30 min测定得出番石榴叶中6种黄酮类成分总量的平均值为0.972%，与傅予的测定结果十分接近。因此可以初步判断，本研究测定的6种成分为番石榴叶中的主要黄酮类物质。不同地区的番石榴叶饮片中黄酮类成分含量存在较大差异。其中，云南地区的番石榴叶中瑞诺苷含量最高，平均值为0.090 1%。四川地区的番石榴叶中异槲皮苷、番石榴苷、萹蓄苷含量最高，平均值分别为0.258%、0.242%、0.258%。广西地区的番石榴叶中金丝桃苷、槲皮素含量最高，平均值分别为0.238 1%、0.021 6%。槲皮素是番石榴叶中主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化[11]、抗菌、抗病毒，抗腹泻等作用，因此可以初步判断广西地区的番石榴叶质量较四川、云南、贵州地区好。本实验首次将QAMS法应用于番石榴叶的质量评价中，用该法测定了11批番石榴叶药材中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，与传统外标法所得含量之间没有显著性差异。证明该方法可靠性强，同时可节约成本，可以在缺少对照品的情况下，通过fk/s及色谱峰定位计算其量，实现番石榴叶中多种有效成分质量控制。
