圆珠半夏带顶芽块茎组培快繁体系的构建
2019-10-10罗夫来王华磊罗春丽李金玲刘红昌黄明进
朱 健， 罗夫来， 赵 致， 王华磊， 罗春丽， 李金玲， 刘红昌， 黄明进
(1.贵州大学 农学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省中药材繁育与种植重点(工程)实验室， 贵州 贵阳 550025)
半夏是我国传统中药材，有燥湿化痰、镇吐及催吐、抗肿瘤、抗早孕等作用[1-3]。大方圆珠半夏是贵州省大方县境内种植或野生的半夏(Pinelliaternata)，为天南星科植物，具有个大色白、棕眼明显、质地坚实、粉性足等特点，属于半夏优质药材。2012年获得国家地理标志产品保护认证。大田种植主要用块茎播种，用种量大，种子成本高，对半夏药材生产造成较大限制。而基于植物组织培养的快繁技术，具有速度快、成本低、效率高等优点，在种苗繁育研究中被广泛应用。半夏叶片、叶柄、块茎都可以作为外植体用于组培快繁，且已有较多文献报道。笔者所在课题组在进行半夏组培快繁研究时发现，以半夏块茎顶芽或带顶芽的块茎切块为外植体时，其组织培养快速繁殖所需要的条件与叶片、叶柄、不带顶芽块茎所需的生长调节剂浓度及其组合完全不同。为此，笔者等以圆珠半夏带顶芽块茎为外植体开展了顶芽萌发、愈伤组织和丛生芽诱导等研究，以期为丰富半夏组培快繁资料及半夏种苗繁育提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
圆珠半夏：采自贵州省大方县，为人工种植，经鉴定为天南星科植物半夏(Pinelliaternata)。
1.2 方法
以MS培养基为基本培养基，考察不同生长调节剂及其比例对外植体和培养物的影响。
1.2.1 试验设计
1) 单因素试验。以蒸馏水为对照，分别研究不同浓度6-BA、NAA、2,4-D对外植体形成愈伤组织的效应。其中，生长调节剂6-BA 的浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L和2.0mg/L，NAA的浓度分别为0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L，2,4-D的浓度分别为0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L。
2) 正交试验设计。在单因素试验的基础上，以6-BA浓度(A)、NAA浓度(B)和2,4-D(C)为考察因素，设置4个水平，采用L16(43)正交试验筛选俞伤组织形成、诱导顶芽萌发和丛生芽形成的生长调节剂最佳组合。其因素水平见表1。
表1 圆珠半夏带顶芽块茎组培的生长调节剂因素及水平
Table 1 Factors and levels of growth regulators in tissue culture ofP.ternatawith apical buds
水平Level6-BA/(mg/L)NAA/(mg/L)2,4-D/(mg/L)10 0 0 20.80.10.131.00.20.241.20.30.3
1.2.2 外植体准备、接种与培养 外植体准备：选取无病虫害健壮饱满的圆珠半夏块茎，剥去表皮，用清水冲洗3～5 min，在无菌工作台上用75%酒精消毒40 s，用无菌水冲洗2～3次，用0.1%升汞灭菌12～15 min，再用无菌水冲洗3～5次，置灭菌滤纸上吸干水分，备用。
接种与培养：每个生长调节剂处理接种10瓶，每瓶接种3块带顶芽块茎。培养条件为25℃，空气相对湿度80%，光照强度2 000～2 500 Lx，光照时间15 h/d，培养30 d后观察。
1.2.3 指标测定 观测并记录不同处理圆株半夏顶芽块茎的芽萌发数，形成愈伤组织数及从生芽数，并计算芽萌发率及愈伤组织形成率。
萌发率=芽萌发数/接种数×100%
愈伤组织形成率=形成愈伤组织数/接种数×100%
2 结果与分析
2.1 不同浓度生长调节剂对圆珠半夏带顶芽外植体形成愈伤组织的诱导效应
2.1.1 6-BA 6-BA对圆珠半夏带顶芽外植体形成愈伤组织有促进作用，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，诱导形成的愈伤组织数最多，达26块，且愈伤组织呈绿色，表面有较多凸起的小颗粒，显著优于其余处理；其余各处理形成的愈伤组织均在20块以下，且愈伤组织状态较差(表2)。因此，6-BA诱导带顶芽外植体形成愈伤组织的最适浓度为1.0 mg/L。
表2 不同浓度生长调节剂的对圆珠半夏顶芽外植体形成愈伤的诱导效应
注：表中同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level.
2.1.2 NAA NAA对圆珠半夏带顶芽外植体形成愈伤组织有显著促进作用，且NAA各浓度处理诱导的愈伤组织数均显著高于对照。当NAA浓度为0.2 mg/L时，诱导的愈伤组织数最多，达29块，且愈伤组织呈绿色，表面有较多凸起的小颗粒，优于其余处理，但不同浓度间差异不显著(表2)。因此NAA诱导带顶芽外植体形成愈伤组织的最适浓度为0.2 mg/L。
2.1.3 2,4-D 2,4-D对圆珠半夏带顶芽外植体形成愈伤组织有促进作用，除0.8 mg/L以外，其余各浓度2,4-D处理均显著优于对照。当2,4-D浓度为0.2 mg/L时，诱导外植体形成的愈伤组织数最多，达24块，且愈伤组织呈绿色，表面有较多凸起的小颗粒，优于其余处理，但不同浓度间差异不显著;其余各处理形成的愈伤组织数均在20块以下，且愈伤组织状态较差(表2)。因此，2,4-D诱导带顶芽外植体形成愈伤组织的最适浓度为0.2 mg/L。
2.2 不同生长调节剂组合对圆珠半夏组织培养的促进作用
2.2.1 块茎顶芽萌发 由表3可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 诱导顶芽萌发的最优水平分别为A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L和2,4-D 0.2 mg/L。经方差分析表明，6-BA、NAA不同浓度诱导圆珠半夏的顶芽萌发数差异达显著水平，2,4-D不同浓度诱导圆珠半夏的顶芽萌发数差异达极显著水平。经多重比较表明，A4萌发数最多，A2、A3、A4均极显著高于A1，但A2、A3、A4之间差异不显著；B4萌发数最多，极显著高于B1、B2和B3，B1和B3极显著高于B2，B1与B3差异不显著；C3萌发数最多，极显著高于C1、C2和C4， C2极显著高于C1和C4，C1与C4差异不显著。因此，在以MS为基本培养基，促进顶芽萌发的最优生长调节剂水平组合为A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。
表3 不同生长调节剂组合对圆珠半夏顶芽块茎萌发的促进作用
注：K，各因素某一水平芽萌发数结果之和。
Note:Kindicates the sum of bud germination number of each factor at certain level.
2.2.2 愈伤组织 由表4可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 诱导愈伤组织形成的最优水平分别为A3、B4和C3，即6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.3 mg/L。经方差分析表明，6-BA各浓度诱导带顶芽块茎形成愈伤组织块数差异达显著水平。NAA和2,4-D各浓度诱导带顶芽块茎形成愈伤组织块数差异不显著。经多重比较表明，A3诱导的愈伤组织块数最多，极显著高于A1、A2和A4，A3、A4极显著高于A1、A2，A2极显著高于A1。NAA和2,4-D各水平诱导愈伤组织数差异不显著，最优水平可选愈伤组织数最多的B4和C4。因此，以MS为基本培养基，诱导带顶芽块茎形成愈伤组织的最优生长调节剂水平组合为A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。
表4 生长调节剂组合诱导圆珠半夏带顶芽块茎形成的愈伤组织情况
注：K为各因素某一水平形成愈伤组织数之和。
Note:Kindicates the sum of callus number of each factor at certain level.
2.2.3 丛生芽 由表5可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 诱导带顶芽块茎形成丛生芽的最优水平分别为A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.2 mg/L。经方差分析表明，6-BA、NAA、2,4-D各浓度诱导丛生芽数差异达极显著水平。经多重比较表明，A4诱导丛生芽数最多，极显著高于A1、A2、A3，A3极显著高于A1、A2，A2极显著高于A1；B4诱导丛生芽数最多，极显著高于B1、B2和B3，B1极显著高于B2和B3， B3极显著高于B2；C3诱导丛生芽数最多，极显著高于C1、C2和C4，C2极显著高于C1和C2，C1与C4差异不显著。表明，以MS为基本培养基，诱导丛生芽的最优生长调节剂水平组合为A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。
表5 生长调节剂组合对圆珠半夏带顶芽外植体丛生芽的诱导效应
注：K为各因素某一水平的从生芽数之和。
Note:Kindicates the sum of apical bud number of each factor at certain level.
3 结论与讨论
半夏组织培养一般使用6-BA、NAA及2,4-D等调节剂经过数次继代完成[4-7]。试验表明，以圆珠半夏带顶芽块茎为外植体进行组织培养时，不同浓度的6-BA、NAA、2,4-D及其组合对顶芽萌发、愈伤组织和丛生芽诱导具有显著或极显著促进作用。以MS为基本培养基，诱导圆珠半夏带顶芽块茎形成愈伤组织时，生长调节剂最优水平组合为A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。以MS为基本培养基，诱导圆珠半夏带顶芽块茎顶芽萌发和丛生芽形成时，生长调节剂最优水平组合为A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。半夏生产上多采用小块茎、珠芽等方法进行繁殖，但多代无性繁殖易受病毒侵染，而导致产量和品质下降[8-9]。试验以半夏带顶芽块茎为材料，对半夏组培快繁体进行研究，为半夏块茎组培苗生产提供理论依据和技术支持。
