狗枣猕猴桃查尔酮异构酶1(AkCHI1)的生物信息学分析
2019-10-10李然红王立凤
刘 丹， 李然红， 陈 鑫， 王立凤
(牡丹江师范学院， 黑龙江 牡丹江 157012)
黄酮类化合物是多酚类次生代谢物，在植物体中主要参与植物的生长繁殖、花色形成、抗病性及非生物环境胁迫等生理作用，具有抗氧化、消除自由基等功效。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢途径中关键酶，在黄酮代谢调控方面起重要作用。1987 年，CHI基因首次从法国豌豆中分离出来，随后在玉米、豌豆、菜豆等多种植物中克隆分离到该基因[1-3]。CHI基因为多类型家族，根据特异性分为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ共4种类型[4]，许多植物中同时存在多种类型的CHI基因，如甘草中有2种类型CHI基因，豆科植物百脉根植物中存在3种CHI基因[5-6]。作为黄酮类代谢途径中的关键酶，CHI基因能够调控查尔酮的积累，进而影响其黄酮类化合物的含量，在植物的生长发育、花叶变色、抵抗性等方面作用显著。BEDBAR等[7]研究发现，CHI基因能够影响矮牵牛查尔酮的积累，改变矮牵牛花粉的颜色；同时大麦和洋葱CHI基因失活导致黄酮类化合物的含量急剧下降，而过量表达CHI基因则含量显著提高[8]。狗枣猕猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.& Rupr.) Maxim.〕别名狗枣子，是猕猴桃科(Actinidiacese)猕猴桃属(Actinidia)落叶藤本植物，是最为耐寒的猕猴桃种类之一[9]。目前关于狗枣猕猴桃的研究主要集中在有效物质提取、营养和医药价值开发及繁殖技术上，有关其抗性基因的研究尚少。因此，以狗枣猕猴桃转录组数据为参考，筛选到狗枣猕猴桃查尔酮异构酶AkCHI1的cDNA序列，利用生物信息学方法对其进行预测和分析，以期为AkCHI1功能研究提供参考。
1 资料与方法
1.1 资料
狗枣猕猴桃AkCHI1 cDNA序列从牡丹江师范学院植物遗传育种实验室转录组数据中获得；中华猕猴桃变种(PSR86069.1Actinidiachinensisvar.chinensis)、茶树(XP_028087110.1Camelliasinensis)；芝麻(XP_011079862.1Sesamumindicum)、黑穗槐(XP_021279652.1Herraniaumbratica)、可可树(XP_017977137.1Theobromacacao)、葡萄(CBI28694.3Vitisvinifera)、欧洲橄榄(XP_022864712.1Oleaeuropaeavar.sylvestris)、东方苔草(PON84200.1Tremaorientale)、苹果(XP_008368846.1Malusdomestica)；山黄麻(PON55262.1Parasponiaandersonii)、番木瓜(XP_021898058.1Caricapapaya)、紫花风铃(PIN18250.1Handroanthusimpetiginosus)、核桃(XP_018856033.1Juglansregia)、榴莲(XP_022771113.1Duriozibethinus)、马铃薯(XP_006352775.1Solanumtuberosum)、美女烟草(XP_009803839.1Nicotianasylvestris)、番茄(XP_004242334.1Solanumlycopersicum)等植物氨基酸序列在NCBI数据库中下载。
1.2 方法
AkCHI1的理化性质用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)进行分析；NCBI-CDD进行保守结构域及蛋白家族预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence-search)预测功能位点；NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)对N-糖基化位点进行预测；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)对O-糖基化位点进行预测；采用 PredictProtein 数据库(https://www.predictprotein.org/)对AkCHI1蛋白进行二级结构预测；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在线软件预测蛋白质三级结构。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得18条不同植物的氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法构建蛋白质系统进化树。
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2 结果与分析
2.1 AkCHI1的理化性质
对AkCHI1氨基酸序列分析表明，狗枣猕猴桃AkCHI1基因cDNA全长为1 168 bp，编码区(CDS)为cDNA上第81～941个碱基，共编码287个氨基酸，分子量31 610.03 D，理论等电点为9.30，负电荷残基总数(Asp+Glu)为33，正电荷残基总数(Arg+Lys)为41，分子式为C1386H2242N402O424S9，总原子数4 463，亲水性(GRAVY)的平均水平为-0.237。不稳定指数为55.60，说明该蛋白非稳定。由图1可见，该蛋白中含量最多的为丝氨酸，占11.5%，其次为亮氨酸和精氨酸，各占9.8和8.4%，含量最少的为色氨酸，为0.3%。经预测(图2)，该基因蛋白的整个肽链中均含有亲水性和疏水性氨基酸，得分的最大值为2.122，在36个氨基酸处；最小值为-2.511，在24个氨基酸处。蛋白质存在3个高分值(>2)，6个低分值(<-2)，根据蛋白质亲水和疏水的得分判定该蛋白为亲水蛋白。
图1 AkCHI1基因编码蛋白质的氨基酸组成
Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHI1 gene
图2 AkCHI1蛋白的亲水/疏水性
Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHI1
2.2 AkCHI1的信号肽及跨膜结构
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注：C值、S值和Y值分别是原始剪切位点、信号肽和综合剪切位点的分值。
Note: The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.
图3 AkCHI1蛋白的信号肽及跨膜结构
Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkCHI1
2.3 AkCHI1功能位点及结构域
由表1可见，AkCHI1上含有8个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位点、3个十四烷酰化位点。对N-糖基化位点进行预测表明，该蛋白内有1个潜在的N-糖基化位点，在67(NRSS)氨基酸处。O-糖基化是另一种重要的蛋白质翻译后修饰，O-糖链能维持所连接蛋白质部分的空间构象，NetOGlyc4.0 server对O-糖基化位点进行预测，预测分数均大于0.5的认为是阳性，故推测该蛋白内共含11个O-糖基化位点。
2.4 AkCHI1的二级、三级结构
对AkCHI1的二级结构预测表明，组成AkCHI1的287个氨基酸中，42.51%的氨基酸可能会形成螺旋，19.86%的氨基酸可能形成延伸链，3.14%的氨基酸可能形成转角，34.49%的氨基酸可能形成无规则卷曲，无二硫键和特殊的二级结构。对AkCHI1蛋白进行三级结构预测(图5)，该结构主要由螺旋和无规则卷曲组成，在第82～283个氨基酸组成的三级结构，含有查尔酮异构酶结构域。
经预测(图3)，AkCHI1蛋白不含信号肽，D值为0.196(<0.450)，不存在跨膜结构。
图4 AkCHI1蛋白的保守序列
图5 AkCHI1蛋白的三级结构
Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHI1 protein
2.5 AkCHI1的蛋白质修饰位点
对AkCHI1保守序列及蛋白家族预测表明，AkCHI1同时具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)家族的一员(图4)。
2.6 AkCHI1的氨基酸序列同源性
AkCHI1氨基酸序列与18种植物的CHI氨基酸序列进行同源性分析表明(图6)，狗枣猕猴桃与榴莲的亲缘关系较近，而与葡萄等植物的亲缘关系较远。
2009年新修订的《欧盟排放交易指令》对2012年年底之前注册的项目从2013年起产生的CERs作了详细说明，在未达成有法律效力的国际减排协议的情况下，欧盟各成员国至少在2015年5月31日前有权利但非义务使用特定项目类型的CERs。欧盟气候委员会于2011年1月21日通过的草案明确规定，2013年1月1日起 EU—ETS不得使用来自HFC23项目和己二酸N2O项目产生的 CERs，2013年前产生的 CERs可以使用到2013年4月30日。
表1 AkCHI1蛋白的修饰位点
图6 CHI1的蛋白系统进化树
Fig.6 System phylogenetic tree of CHI1
3 结论
CHI基因具有调节植物组织颜色及调控类黄酮生物合成的主要功能，在番茄等植物中分析得到，CHI基因能够控制花瓣、果皮等组织的颜色，并在黄酮类物质代谢中是关键酶类[1]。因此，分析筛选AkCHI1基因cDNA序列信息，并对其进行生物信息学分析，为进一步研究狗枣猕猴桃花叶及黄酮类物质代谢调控机制提供依据。结果表明，AkCHI1基因cDNA总长1 168 bp，CDS为861 bp，编码的蛋白由287个氨基酸构成。具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)超家族的一员，为亲水性非稳定的蛋白。在NCBI数据库中进行BLAST，与AkCHI1相比的100条CHI基因的氨基酸序列中，一致性最高的达到96.04%，最低的也为57.67%，说明在不同的植物中，CHI基因的氨基酸序列十分保守。选取18条氨基酸序列与AkCHI1进行比对表明，狗枣猕猴桃与榴莲的亲缘关系较近，而与葡萄等植物的亲缘关系较远。
