益母草微粉饲料原料的鉴别与测定

刘永录， 李艳玲， 郭振环， 马 霞*， 王 林， 张国祖

(1.河南牧业经济学院， 河南 郑州 450011； 2. 河南省康星生物科技有限公司， 河南 焦作 454950； 3.河南省康星药业股份有限公司， 河南 郑州451464)

超微粉碎技术是指利用机械或流体动力的方法，将物料颗粒粉碎至微米级甚至纳米级微粉的过程。中药微粉碎利用机械或流体动力将中药材颗粒粉碎到粒径为微米级或纳米级，使中药细胞破壁率达90%以上，可充分释放细胞内的有效成分，使其可直接接触溶剂，从而提高药材的生物利用度[1-2]，达到更好的用药效果。但中药材经超微粉碎后，细胞壁被打破，中药材的微观特征已被彻底破坏，传统的中药材鉴别方法已不再适用，有必要找到一个更有效的方法来控制中药微粉的质量。

益母草是兽医临床上常用的中药，在2012年中华人民共和国农业部公告第1773号中被列入《饲料原料目录》，其具有活血调经、安胎止痛等功效，可以用于母畜不孕、产后恶露不止等症的治疗[3-4]。为使益母草的功效发挥最大，将其制备成微粉。经超微粉碎后可加速其有效成分的溶出速度，增强疗效。但目前还没有针对益母草微粉质量研究的文献报道。因此，笔者对益母草微粉进行薄层色谱(TLC)鉴别，并使用激光粒度分析仪对其粒径进行检测，同时采用高效液相色谱(HPLC)法测定益母草碱的含量并制定含量限度，以期为益母草微粉饲料原料的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品：10批300目益母草微粉样品，河南省康星药业股份有限公司生产。

仪器与试剂：LRVM-MHS-BE 型高频震动研磨机(山东龙脉科技发展有限公司)， Winner3003 型智能型激光粒度分析仪(济南微纳颗粒仪器股份有限公司)，1100 型HPLC 仪(美国Agilent 公司)，AUW220D型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。盐酸水苏碱对照品(含量以99.6%计，批号110712-201111，中国生物制品检定所)，盐酸益母草碱对照品(含量以94.7%计，批号111823-201202，中国生物制品检定所)，甲醇(上海试剂一厂)，乙腈(天津市四友精细化学品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 薄层鉴别

1) 对照品溶液的制备。取盐酸水苏碱对照品，加无水乙醇制成浓度为1 mg/mL的溶液，即为对照品溶液。

2) 供试品溶液的制备。精密称取益母草微粉样品1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，记录重量，加热回流2 h，放冷至室温，再次称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤取滤液，即得。

3) 点样和展开。分别吸取对照品溶液及供试品溶液10 μL，各点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)为展开剂展开，取出，晾干，在105℃加热15 min后放冷至室温，喷以稀碘化铋钾试液-三氯化铁试液(10∶1)混合溶液至斑点显色清晰。

1.2.2 益母草微粉粒径的检测 选用Winner3003干粉激光粒度仪，对10批益母草微粉样品进行粒径分布检测。取适量样品置于激光粒度分析仪的样品槽中，使样品平铺均匀。操作粒度分析仪上吸尘、送气、进样，激光粒度分析仪自动测量出粒径分布及结果。

1) 仪器的精密度考察。取标样金刚砂重复进样6次，检测粒径分布，统计D50(指50%的颗粒小于某个粒径值)和D90的RSD，考察仪器精密度。

2) 水分的考察。取含水量分别为5.7%、6.3%、7.7%和8.6%的益母草微粉进行粒径分布检测，统计<48 μm和>75 μm粒径分布情况。

3) 重复性考察。取同一批次益母草微粉重复进样6次，测定粒径分布，统计<48 μm和>75 μm粒径分布，计算RSD。

4) 稳定性试验。取同一批次益母草微粉分别在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h及24 h进样测定其粒径分布。

5) 10批药材样品的粒度检测。取10批药材制备的益母草微粉，每批分别进样3次进行检测，统计结果，确定<48 μm粒子所占的百分比限度和>75 μm粒子所占百分比限度[5]。

1.2.3 益母草碱含量的测定

1) 色谱条件与系统适用性考察。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈0.4%辛烷磺酸钠的0.1%磷酸溶液(24∶76)为流动相,检测波长为277 nm。理论板数按盐酸益母草碱峰计算应不低于6 000。

2) 对照品溶液的制备。精密称定盐酸益母草碱对照品5.68 mg，置于200 mL量瓶中，加70%乙醇溶剂并定容至刻度，制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

3) 供试品溶液的制备。精密称取益母草微粉1 g，放入具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热回流2 h后放冷至室温，再称量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得。

4) 专属性考察。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样，在前述色谱条件下进行测定。

5) 线性关系考察。分别精密吸取对照品溶液5 μL、8 μL、10 μL、15 μL和20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，将所得到的峰面积与对照品进样质量进行线性回归。

6) 样品的含量测定。分别对十批不同药材来源制成的益母草微粉按照上述建立的方法处理，测定益母草微粉中益母草碱的含量。

2 结果与分析

2.1 薄层鉴别

从图1可知，在与对照品相对应的位置供试品均出现了相应的红色斑点，空白溶剂未出现干扰，表明，该方法能有效鉴别出益母草微粉中的盐酸水苏碱成分。

注：1，水苏碱；2～4，益母草微粉样品；5，空白溶剂对照

Note:1, stachydrine; 2-4,L.heterophyllusmicropowder samples; 5, blank solvent control

图1益母草微粉薄层鉴别

Fig.1 TLC identification ofL.heterophyllusmicropowder

2.2 益母草微粉的粒径

2.2.1 仪器的精密度 从表1可知，金刚砂的D50平均值为25.83 μm，在标准值(26±0.7)μm的范围内，且D50的RSD为0.69%。D90的平均值为37.50 μm，RSD为1.65%。表明，Winner3003干粉激光粒度仪的精密度良好。

表1 益母草微粉粒径测定的精密度及重复性

Table 1 Precision and repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

μm

注：D50和D90的RSD分别为0.69%和1.65%。

Note:RSDs of D50and D90were respectively 0.69% and 1.65%.

2.2.2 水分 从表2可知，益母草微粉不同含水量(5.7%～8.6%)<48 μm的平均粒径为98.35%，RSD为0.56%，差异不显著。说明水分在9.0%之下对粒径检测结果影响不大，但水分大于9.0%时，微粉易结块、仪器易堵塞，对检测结果影响较大。

表2 益母草微粉不同含水量样品的粒径分布比例

Table 2 Particle size distribution ratio ofL.heterophyllusmicropowder with different moisture content

%

2.2.3 重复性试验 从表3可知，<48 μm的粒径分布平均为99.09%，RSD为0.31%。说明该方法的重复性良好，满足粒径测定要求。

表3 益母草微粉粒径测定的重复性

Table 3 Repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

编号No.<48 μm粒径分布<48 μm particle distribution>75 μm粒径分布>75μm particle distribution199.550.03299.060.14399.030.12498.580.26599.110.12699.190.11平均 Mean99.090.13RSD0.31-

2.2.4 稳定性 从表4可知，24 h内<48 μm的粒径分布平均值为98.37%，RSD为0.43%。表明供试品粒径在室温条件下放置24 h内稳定。

表4 益母草微粉粒径测定的稳定性

Table 4 Stability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

%

2.2.5 10批药材样品的粒经 从表5可知，10批样品的粒经小于48 μm颗粒百分比为97.83%～99.63%，平均值为 98.61%，RSD为0.75%；大于75 μm颗粒百分比为0.05%～0.50%，平均值为0.26%。根据取整数原则，将益母草微粉粒径的上限设定为小于48 μm颗粒百分比不低于95%，而上限定为大于75 μm颗粒百分比不超过1.0%较为适宜。

表5 10批益母草微粉的粒径检测结果

Table 5 Particle size distribntion ratio of 10 batches ofL.heterophyllusmicropowder %

批次Batch No.<48 μm颗粒的占比<48 μm proportion>75 μm颗粒的占比>75 μm proportion1607020199.530.051607020297.830.501607030197.880.451607030299.190.051607040197.920.491607040298.380.191607050199.630.061607050299.400.091607060198.050.431607060298.270.27平均 Mean98.610.26限度Limitation951

2.3 益母草碱的含量

2.3.1 专属性 在供试品色谱中，对照品位置相同保留时间出现了益母草碱峰，说明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系 经测定，峰面积与对照品进样质量的线性回归方程为y=1 482.8x-21.076，R= 0.999 6。表明盐酸益母草碱进样量在0.15～0.60 μg时，进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.3 样品的含量测定 从表6可知，10批益母草微粉的益母草碱含量变幅为0.073%～0.081%，平均值为0.077%。根据兽药有效成分含量限度制定原则，选取10批不同药材来源样品均值的80%作为最低限度，即益母草碱的含量应不低于0.06%，即益母草微粉含益母草碱不得少于0.60 mg/g。

表6 10批益母草微粉益母草碱的含量

Table 6 Content ofL.heterophyllusalkaloid in ten batches ofL.heterophyllusmicropowder

批号Batch No.含量/% Content批号Batch No.含量/% Content160702010.073160704020.081160702020.074160705010.078160703010.077160705020.077160703020.079160706010.075160704010.081160706020.075

3 结论与讨论

试验表明，在薄层图谱中，供试品在对照品斑点位置出现相应斑点，且无干扰，可用于益母草微粉的鉴别；益母草微粉粒径的上限为小于48 μm颗粒百分比不低于95%，下限为大于75 μm颗粒百分比不超过1.0%。HPLC检测中，益母草碱的进样量为0.15～0.60 μg时，进样量与峰面积线性关系良好(r=0.999 6)；10批样品的益母草碱含量变幅为0.073%～0.081%，平均为0.077%。建议控制益母草饲料原料中益母草微粉含益母草碱不少于0.60 mg/g。

含量测定方法首要参考了2015版《中华人民共和国兽药典》[6]，采用高效液相色谱法分别从称样量、稀释倍数和进样量等方面进行优化，获得了稳定准确的含量测定方法；可以认为，益母草微粉中益母草碱含量不低于0.06%即为合格，所以益母草碱可作为其质量控制的定量指标。

粒径检测是区别于传统散剂的一个重要手段。微粉的粒度检查采用激光衍射法，参考《中华人民共和国兽药典》2015年版一部粒度和粒度分布测定法第3法(光散射法)[7]，选用的检测仪器为Winner 3003干粉激光粒度仪。干法检测适用于一切粉体颗粒，不受颗粒物理、化学性质的限制，不仅适用于在液体中发生形状变化、发生化学反应或损失其成分的颗粒，还适用于磁性颗粒。药典上规定的细粉、最细粉和极细粉均标明通过相应目数筛网的比例不少于95%。益母草微粉的粒度为300目(48 μm)，因此将粒径标准定为小于48 μm的粒子不少于95%。200目对应的粒径大小为75 μm，因此将大于75 μm的粒子作为粒径的上限。