尿酸对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响

关宝生 张睿迪 白雪 王景涛 尹相林 王嘉淇 曹刘芳 王健宇 刘良辰 邱洪斌

(1佳木斯大学公共卫生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2黑龙江省痛风研究重点实验室；3佳木斯大学基础医学院)

高尿酸血症(HUA)是由于体内嘌呤代谢异常，导致血尿酸(SUA)生成过多和(或)排泄障碍而引起的一种代谢性疾病。中国大陆地区31个省、市、自治区成人的HUA患病率由1985年的15%左右上升至2017年的20%左右〔1〕。尿酸(UA)是人体重要的代谢产物，正常生理水平的UA是一种天然的抗氧化剂，具有多重抗氧化能力，能够清除氧自由基和活性氧〔2,3〕。然而，当机体UA水平持续升高，则会影响机体氧化-还原系统的平衡，表现出明显的促氧化作用，能够促进自由基链式反应的其他自由基产生，诱发机体氧化应激，从而损伤细胞，并与高血脂、糖尿病、冠心病和脑卒中等众多疾病的发生、发展关系密切〔4〕。Xue等〔5〕随机抽取58例轻度认知功能障碍(MCI)患者和57例健康老年人进行微型精神状态检查，并观测其体内SUA水平与MCI发生发展的关系；其研究结果显示，MCI组UA水平显著低于正常对照组，提示低水平SUA是MCI的危险因素，适当增加SUA水平可延缓MCI的发生和发展。果蝇是一种重要的模型生物，在神经生物学研究方面具有重要的作用。本研究通过高嘌呤饮食构建果蝇HUA模型，探讨UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1果蝇品系及饲养条件 选用W1118野生型黑腹果蝇，为佳木斯大学尿酸功能研究团队自有。果蝇均饲养在恒温恒湿培养箱中，培养温度设为(25±0.5)℃，湿度设为(40±0.5)%、光照周期为12 h。果蝇饲养使用标准玉米粉培养基。

1.2实验试剂 腺嘌呤购于北京索莱宝生物科技有限公司；酵母购于英联马利(英国联合食品集团)；逆转录试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3实验仪器 果蝇嗅觉行为测试设备购自苏州卓凯生物技术有限公司；聚合酶链反应(PCR)仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4实验分组 根据前期预实验，共设3个组别，对照组(标准玉米粉培养基)、低浓度干预组(腺嘌呤浓度为0.1%的培养基)、高浓度干预组(腺嘌呤浓度为0.3%的培养基)。收集羽化后的果蝇10 200只，每组3 400只果蝇，雌雄各半。

1.5果蝇体内UA水平的测定 每组取25只果蝇并称重，按重量(g)∶蒸馏水(ml)=1∶9的比例，用玻璃匀浆器制成组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA检测果蝇体内UA水平。

1.6果蝇嗅觉学习记忆能力相关指标的检测

1.6.1嗅觉学习记忆能力测试所需气味的制备 0.15% 3-辛醇(OCT)：按照每100 ml石蜡油中溶解150 μl OCT配置。0.10% 4-甲基环己烷(MCH)：按照每100 ml石蜡油中溶解100 μl MCH配置。

1.6.2嗅觉学习记忆能力的测定 每次取100只果蝇进行嗅觉行为测试，在温度(25±0.5)℃、湿度(70±0.5)%、620 nm红光灯暗房的条件下，将上述两种气味接入自动嗅觉行为测试设备，其中一种气味伴随电击，对果蝇嗅觉行为进行干预后将果蝇放入T-Maze中间的空腔中，左右两侧接入相同气体，观察果蝇趋避有害因素的行为，随后记录选择两种气味的果蝇数量。重复上述测试，更换另一种气味伴随电击，并做好记录。分别对雌雄性果蝇进行测定，每个性别果蝇进行8次行为测试，结果取平均值。最后计算果蝇行为反应指数(PI)，指数为0表示没有学习记忆能力，指数为正则表示有学习记忆能力，指数为负则表示结果无效。PI=(PIOCT+PIMCH)/2×100；PIOCT=(XMCH-XOCT)/X总；PIMCH=(XOCT-XMCH)/X总。X代表选择每种气味的果蝇数。

1.6.3应用逆转录(RT)-PCR检测嗅觉相关基因mRNA的表达 取培养7 d的果蝇，每组雌雄各20只，应用Trizol法提取RNA，以RT-PCR法测定果蝇体内Rugose(Rg)、锌指蛋白轮状体(Rn)和Tau嗅觉相关基因mRNA的表达水平，以β-actin为内参基因，结果以目的基因的光密度/内参基因的光密度表示，引物为正义：TGCTGCTCCACCATGCCATTAAG，反义：CTCCAGTTCCTCCACCTCTTCCT；Rn正义：GCCTTCGCCAACTCGTCGTATC，反义：TGTGCTTGGTCAGGTAGGTCTCC；Tau正义：ACAATGACAGCGGCGTGGATG，反义：GGTCTTGAGGAGCAAGCGGTTC；β-actin正义：GCATCCACGAGACCACCTACAAC，反义：AGCCACCGATCCAGACAGAGTAC。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1果蝇体内UA水平 随着培养基中腺嘌呤浓度的升高，与对照组比较，各干预组果蝇体内UA水平显著升高(P<0.01)。各干预组组内雌雄性果蝇体内UA水平也存在明显差异，低浓度干预组雄性果蝇体内UA水平显著高于雌性果蝇，但在高浓度干预组雌性果蝇体内UA水平显著高于雄性果蝇(P<0.01)。见表1。

表1 各组果蝇体内UA水平

与对照组比较:1)P<0.01，与雌性果蝇比较:2)P<0.01

2.2UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响 随着果蝇体内UA水平的升高，与对照组比较，低浓度干预组雄性果蝇的嗅觉学习记忆能力明显升高(P<0.05)；高浓度干预组雄性果蝇的嗅觉学习记忆能力较低浓度干预组略降低。雌性果蝇随着体内UA水平的升高其嗅觉学习记忆能力出现明显的降低趋势，但与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组果蝇嗅觉学习记忆能力的变化

与对照组比较:1)P<0.05

2.3各组果蝇嗅觉相关基因的表达 与对照组比较，雄性果蝇低浓度干预组Rg、Rn基因的表达量有增高的趋势，但差异不具有统计学意义，高浓度干预组Rg、Rn基因的表达量显著升高(P<0.05)；与对照组比较，雄性果蝇低浓度干预组Tau基因的表达量明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，高浓度干预组Tau基因的表达量却显著降低(P<0.05)。与对照组比较，雌性果蝇低浓度干预组Rg基因的表达量显著升高(P<0.05)，而高浓度干预组Rg基因的表达量显著降低(P<0.01)。与对照组比较，雌性果蝇低浓度干预组Rn基因的表达量有增高的趋势，但差异不具有统计学意义，而高浓度干预组Rn表达量显著降低(P<0.05)。与对照组比较，雌性果蝇低浓度与高浓度干预组雌性果蝇Tau基因的表达变化不明显(P>0.05)。见表3，图1。

表3 各组果蝇Rg、Rn和Tau基因mRNA的表达

与对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

1 对照组(雌)，2 低浓度干预组(雌)，3 高浓度干预组(雌)，4 对照组(雄)，5 低浓度干预组(雄)，6 高浓度干预组(雄)图1 各组Rg、Rn、Tau基因mRNA表达

3 讨 论

本研究结果证明果蝇HUA模型建立成功。低浓度干预组雌性果蝇体内的UA水平显著低于雄性果蝇组，提示雌激素可能抑制了UA的生成和(或)促进其排泄；而高浓度干预组雌性果蝇体内的UA水平则显著高于雄性果蝇组，提示雌激素的作用可能被抑制。

本研究显示，提高雄性果蝇体内UA水平可明显促进其嗅觉学习记忆能力，但随着UA水平的进一步升高，则表现出一定的抑制作用。然而，雌性果蝇呈现完全不一样的结果，UA不仅不能提高雌性果蝇的嗅觉学习记忆能力，还表现出一定的抑制作用，推测可能与其体内雌激素对UA代谢的影响有关。以上研究结果提示UA可能通过调控果蝇体内嗅觉学习记忆相关基因的表达，从而影响其嗅觉学习记忆能力。

Tau基因是一种果蝇的微管相关蛋白，主要存在于中枢神经系统神经元轴突中〔6〕。研究发现Tau蛋白激酶与磷酸酯酶功能失衡，引起Tau蛋白磷酸化的异常升高，打破其与微管结合的动态平衡，使Tau蛋白发生异常聚集、纤维化和神经纤维缠结，导致神经元轴突转运障碍，并抑制乙酰胆碱释放及蛋白酶体的活性，导致神经元呈慢性进行性变性〔7～13〕。同时，有研究发现阿尔茨海默病与神经元细胞中Tau的异常磷酸化和表皮生长因子受体(EGFR)信号相关〔14,15〕。果蝇中Rg是哺乳动物和人神经信号蛋白(NBEA)的同源物，是一种与突触处的神经递质/内膜囊泡运输有关的支架蛋白。有研究显示，携带Rg突变体的果蝇表现出与人NBEA缺失所致自闭症相似的学习缺陷和认知障碍，并与EGFR和delta-notch通路的基因存在相互作用〔16～19〕。Rn在果蝇嗅感受器神经元前体中表达，对其嗅觉系统发育的控制起至关重要的作用〔20〕。

本研究发现，UA对雌性果蝇和雄性果蝇Rg、Rn和Tau基因mRNA的表达变化存在不同的影响，在雄性果蝇中，Rg和Rn基因mRNA的表达量随着UA水平的升高而升高，而Tau基因mRNA的表达量却呈现先升高后降低的趋势。然而，在雌性果蝇中，Rg和Rn基因mRNA的表达量随着UA水平的升高呈现先升高后降低的趋势，Tau基因mRNA的表达量几无变化。本研究发现，UA可能不是通过调控果蝇体内Rg和Rn基因表达而影响其嗅觉学习记忆能力，或者也可能是因为雌激素的存在掩盖了UA对雌性果蝇嗅觉学习记忆能力的影响。然而Tau基因的表达变化与果蝇嗅觉学习记忆能力的变化趋势基本一致，提示Tau在UA对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响方面可能扮演着重要的角色。因此，下一步拟通过果蝇HUA模型进一步探讨UA对Tau基因的调控作用，揭示其机制，并验证雌激素对UA代谢的影响。