血液分离肺炎克雷伯菌毒力基因与耐药性研究

赵金云 许文芳 金法祥

(绍兴市立医院检验科，绍兴 312000)

肺炎克雷伯菌是医院获得性感染及社区获得性感染中常见的条件致病菌，在由革兰阴性菌引起的血流感染中，其分离率仅次于大肠埃希菌，位居第二[1]。20世纪80年代中期到90年代，出现了高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae, HmKP)，与传统肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiella pneumoniae, cKP)相比，高黏液性肺炎克雷伯菌具高表达荚膜的特性，其典型的临床意义是导致化脓性肝脓肿、脑膜炎、眼内炎等重症感染，经常引发播散性感染，病死率高达30%，严重危及人类生命健康[2-3]。本研究旨在比较分析血液标本分离的高黏液性和非高黏液性肺炎克雷伯菌的毒力基因、耐药性特点以及相关临床特征，为加强临床防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集本院2015年1月—2016年12月血流感染分离的非重复肺炎克雷伯菌144株。质控菌株为肺炎克雷伯菌 ATCC700603。

1.2 标本处理

抽取患者20mL血液分别注入需氧和厌氧血培养瓶中，放入BacT/Alert 3D全自动血培养仪，待阳性时转种于血平皿，培养16～18h后，采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定分析仪进行鉴定。

1.3 拉丝试验

用接菌环沾取血平皿上的单个菌落，将接菌环向上提起，拉丝长度大于0.5cm判定为黏液性菌株，拉丝长度≤0.5cm为非黏液性菌株。

1.4 药物敏感性试验

采用纸片扩散法(KB法)，结果按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 2016年版推荐的方法进行判定。

1.5 毒力基因检测

根据文献资料设计相关毒力基因引物，包括荚膜血清型(K1、K2、K54和K57)、rmpA、黏附因子(MrkD)、铁载体相关基因(icuA、iroN和ybtS)、kfu和allS，采用聚合酶链反应(PCR)进行检测。

1.6 数据分析

实验所得数据通过SPSS 17.0统计软件分析，高黏液性和非黏液性细菌的组间差异采用χ2检验，P＜0.05视为有统计学意义。

2 结果

2.1 血流感染分离肺炎克雷伯菌的分子特征

收集的144株肺炎克雷伯菌中，高黏液性菌株共31株(21.53%)，以K1、K2型多见；高黏液性菌株均含有rmpA、mrkD和icuA基因，除mrkD和kfu基因外，其他基因在高黏液性菌株中的比例均显著高于非黏液性菌株(P＜0.01)，如表1所示。

表1 血液分离肺炎克雷伯菌的分子特征Tab.1 Molecular characteristics of Klebsiella pneumoniae isolated from blood

2.2 血流感染分离肺炎克雷伯菌对抗菌药物耐药性

分离菌株对测定抗菌药物的耐药性如表2所示，高黏液性菌株除了对氨苄西林的耐药性为100%外，对其他药物的耐药性均低于20.00%，而非黏液性菌株对抗菌药物的耐药性均高于黏液性菌株，尤其是头孢菌素类、亚胺培南和环丙沙星，具有显著性差异(P＜0.05)。

2.3 肺炎克雷伯菌败血症患者的临床特征

肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者的临床资料如表3所示，87.10%的高黏液性菌株来自男性患者，而非黏液性菌株中，有59.29%为男性患者；与非黏液性菌株相比，高黏液性菌株血流感染更容易引起肝脓肿(P＜0.05)；而两种细菌在致死率方面并无明显统计学差异(P＞0.05)。

表2 血液分离肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药性Tab.2 Antibacterial drugs resistance of Klebsiella pneumoniae isolated from blood

表3 肺炎克雷伯菌败血症患者的临床特征Tab.3 Clinical characteristics of patients with septicemia caused by Klebsiella pneumoniae

3 讨论

肺炎克雷伯菌所致感染存在明显的地域差异，感染主要发生在中国台湾、韩国等亚洲和太平洋沿岸地区，在我国，肺炎克雷伯菌也是院内感染及社区感染最主要的病原菌之一[4]。近年来致病性较强的高黏液表型肺炎克雷伯菌不断出现，逐渐引起人们的关注。

荚膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子。依据荚膜多糖抗原性的不同可分为至少78种血清型，中国台湾研究人员发现，K1、K2型肺炎克雷伯菌具显著表达荚膜特性，能抵抗白细胞的吞噬能力，致病性较强，与肺炎克雷伯菌引起菌血症及肝脓肿等重症感染症密切相关[5]。本次研究中，通过拉丝试验共筛选出31株高黏液性肺炎克雷伯菌，其中70.00%为K1、K2型，显著高于非黏液性菌株(P＜0.01)，但非黏液性菌株中也检测到了K1、K2基因型，因此，荚膜基因型不能作为筛选高黏液性肺炎克雷伯菌金标准。rmpA基因是肺炎克雷伯菌高黏液特性相关的毒力因子，可通过质粒和染色体介导，调控荚膜多糖的过度产生，增强细菌在体外和体内的抗吞噬活性[6]，本研究中，所有高黏液性菌株均含有rmpA基因，且显著高于非黏液型菌株(P＜0.01)；铁载体(siderophores)是肺炎克雷伯菌分泌的一种摄取铁的低分子量化合物，是另一种重要的毒力因子，其特点是对铁有高度亲和力，可以在环境中摄取微量游离的铁或者直接螯合哺乳动物载体蛋白中的铁，参与细菌生长和代谢[7-8]，iucA、iroN、ybtS作为肺炎克雷伯菌铁载体相关基因，超过70.00%的高黏液性菌株含有这些基因，显著高于非黏液型菌株(P＜0.01)，这与Shon等[3]报道一致；mrkD基因是肺炎克雷伯菌的黏附因子，可调节肺炎克雷伯菌在肺和肾脏细胞表面的附着，还可促进细菌与细胞的相互作用[9]，94.44%(136/144)的菌株含有此基因，但mrkD基因在高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌中的含量并无统计学差异(P＞0.05)。

本研究中，分离所得的31株高黏液性肺炎克雷伯菌除对氨苄西林的耐药率达到100.00%(天然耐药)，对其余测定的抗菌药物的耐药率均较低，未发现对碳青酶烯类耐药的高黏液性肺炎克雷伯菌，这与其他研究结果类似，但如表3所示，也出现了个别对氨苄西林以外抗菌药物耐药的高黏液性菌株，Li等[10]报道具有高耐药性、高毒力肺炎克雷伯菌的比例在逐渐增长，因此监测这类菌株的抗菌药物耐药性实属必要。

本次研究收集的菌株大部分来自男性患者，高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌引起的菌血症在不同性别患者方面有一定的差异，但此差异是否具有普遍性还需加大样本量进行进一步研究。本研究以60岁(＞60岁视为老年患者)为分界线，发现高黏液性和非黏液性菌株所引发的菌血症以老年人较多，但在年龄方面两者并无明显差异。通过对患者的临床资料分析发现，高黏液性肺炎克雷伯菌菌血症更易引发肝脓肿等迁徙病灶。自1982年我国首次报道肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)，患KPLA的病例报道和研究越来越多，有研究显示，由肺炎克雷伯菌引起的细菌性肝脓肿高达80%，而近来研究发现，导致细菌性肝脓肿的肺炎克雷伯菌多数黏液丝试验阳性，具有高黏液表型[11-12]。对高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌引起的菌血症患者的病死率进行统计发现，两类肺炎克雷伯菌引起的病死率均在10.00%左右，无统计学差异，可能是因为高黏液性菌株虽然毒力较强，但药物耐药率低，而非黏液性菌株虽然药物耐药率较高，但毒力较弱，近年来由于国家对抗菌药物的有力监管，经过合理的治疗，患者病死率得到了一定控制。

综上所述，本次研究的肺炎克雷伯菌菌血症中，高黏液性肺炎克雷伯菌占有一定比例，且以K1、K2型多见，相对于非黏液性肺炎克雷伯菌，高黏液性菌株血流感染更易引起肝脓肿等迁徙病灶，由于含有更多的毒力基因，高黏液性菌株毒性更强，但药物敏感性较高，应加强对具有高耐药性的高黏液性肺炎克雷伯菌的监控。