一株海绵共附生真菌Fusarium equiseti SCSIO 41019的次级代谢产物及其抑菌活性研究

陈春梅 罗小卫 李坤龙 郭翠 李基兴 林秀萍 刘永宏,*

(1 中国科学院南海海洋研究所，中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东省海洋药物重点实验室，广州 510301；2 中国科学院大学，北京 100049)

海绵是原始的多孔多细胞动物，以过滤性捕食方式富集了大量的微生物[1]。作为海洋底栖生物，海绵的生长环境具有高盐、高压、避光、缺氧、寡营养等特点。海绵共附生真菌因受特殊生存环境的影响而含有丰富的沉默基因，可以形成独特的生理代谢方式，从而产生结构新颖且多样的次级代谢产物[2-4]。另外，海绵结构简单，缺乏有效的物理防御系统，因此海绵共附生真菌在与宿主共同进化过程中，为构成强大的化学防御机制，保护宿主免受竞争者、捕食者以及传染性微生物的威胁，其次级代谢产物多具有显著的生物活性[2]。目前，人们已从海绵共附生真菌中发现大量结构新颖且生物活性显著的次级代谢产物，包括生物碱、聚酮、萜烯、甾体、环肽等，具有抗肿瘤、细胞毒活性、抗病毒、抗疟原虫及抗菌等生物活性[5-6]。金黄色葡萄球菌是临床常见感染的致病菌之一，具有分布广泛、致病性强、耐药率高等特点[7]。此外，MRSA广泛流行，对万古霉素耐药性强[8]。因此寻找新型治疗MRSA感染的药物意义重大。

据文献报道，木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)的主要次级代谢产物为伊快霉素(equisetin)，属于tetramic acid化合物[9]。Tetramic acid是一类以吡咯烷-2,4-二酮为母核的一类生物碱，广泛存在于天然产物中。从土壤真菌Fusariumsp.FN080326分离得到的(+)-fusarisetin A；从海绵Theonellasp.中分离得到的aurantosides A和B以及从雷公藤的内生真菌CryptosporiopsisCF.quercina中分离得到的cryptocin等化合物都属于此类[10-12]。生物活性研究表明，部分tetramicacid化合物具有较好的抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡、除草和抑菌等生物活性[10]。本课题组多年来致力于海洋微生物来源活性先导化合物的发现与挖掘研究，对一株海绵来源真菌Fusarium equiseti进行了次级代谢产物及其抑菌活性研究。从中分离获得8个化合物(图1)，通过波谱学方法分别鉴定为：equisetin(1)、5'-epiequisetin(2)、lumichrome(3)、N-乙酰基色胺(4)、亚油酸(5)、methyl(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、methyl(2-hydroxyphenyl)acetate(7)和graminin B(8)。抑菌活性研究表明，化合物1、2和5对金黄色葡萄球菌和MRSA具有一定的抑制活性。

1 材料和方法

1.1 实验仪器与试剂

AVANCE 700核磁共振仪(德国Bruker公司)；高效液相色谱仪(Hitachi公司)；中压色谱仪(Buchi公司)；EYELAN-1001型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；SHZ-CB型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；KQ-250DB型超声仪(巩义市予华仪器有限公司)；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅(合肥华泰医疗器械有限公司)；薄层硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)；硅胶H(青岛海洋化学仪器厂)；96孔细胞培养板(美国Corning公司)。提取分离所用试剂石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等均为化学纯，购自广州化学试剂厂，液相色谱乙腈、甲醇为色谱纯(美国Merck公司)。

1.2 菌株鉴定

图1 化合物1～8的结构式Fig.1 The structures of compounds 1～8

菌株分离自广东湛江徐闻县采集的美丽属海绵(Callyspongiasp.)的新鲜组织中，编号为SCSIO 41019，标本保存于中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。菌株18S rDNA序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定，将其ITS序列进行BLAST分析，其与菌株Fusarium equisetiisolate JG22 (accession No.KJ412501.1)的ITS序列相似度高达100%。此外，通过构建系统发育树(图2)，最终将该菌株鉴定为Fusarium equiseti。其ITS序列如下：

CTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCA TTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAA CATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGC GCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGAC CCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTA AAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACG GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA GCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG CCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAG CGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTG GGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATT GGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATC ATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACG CCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCG GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGTCGGAGGAA

1.3 菌株发酵

采用大米培养基(大米125g，海盐2g，蒸馏水150g，pH7.4)进行发酵，在116℃下高压蒸汽灭菌20min，冷却后接种，共发酵48瓶，室温静止培养30d。

1.4 代谢产物的提取分离

菌株发酵结束后将大米捣碎，加入等体积乙酸乙酯，超声20min，提取液经浓缩后得棕红色浸膏约50g。然后用100～200目硅胶拌样，经中压柱色谱分离(石油醚/CH2Cl2, 100:0～0:100和CH2Cl2/CH3OH, 100:0～1:1)梯度洗脱后经TLC检识合并得8个流份。Fr.6经ODS中压反相柱色谱(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分离得10个子流份，其中Fr.6-7再用半制备液相(CH3CN/H2O, 65:35)得到化合物1(58mg)和2(133mg)。Fr.2经半制备液相(CH3CN/H2O, 77:23)得到化合物5(7mg)、6(67mg)和7(144mg)。Fr.8经ODS中压反相柱色谱(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分离得5个子流份，Fr.8-2用半制备液相(CH3OH/H2O, 32:68)得到化合物3(5mg)，4(5mg)和8(20mg)。

1.5 抑菌活性测定

1.5.1 滤纸片琼脂扩散法筛选抑菌活性化合物

将待测化合物配成浓度为10mg/mL的甲醇溶液，阳性对照氨苄西林配成0.64mg/mL的甲醇溶液。分别用移液枪吸取10μL待测化合物溶液于直径为6mm的无菌滤纸片上，待甲醇挥干后，将载样滤纸片贴于已涂布100μL×106CFU/mL菌悬液的LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、琼脂粉18g、海盐10g、蒸馏水1L、pH7.4)上，25℃条件下倒置培养24h，每12h观察一次是否产生抑菌圈。以氨苄西林作为阳性对照药物，甲醇作为阴性对照。

图2 基于ITS序列构建的SCSIO 41019与其他镰刀菌属部分代表菌株的Neighbor-joining系统进化树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences showing relationships between strain SCSIO 41019 and closely related members of genus Fusarium

1.5.2 改良肉汤稀释法测定MIC值

对于活性筛选中显示出抑菌活性的化合物，进一步采用改良肉汤稀释法测定MIC。用甲醇分别将待测化合物和阳性对照药物溶解并配至浓度为5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005mg/mL和1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005、0.0025和0.0013mg/mL共11个浓度的稀释液。于96孔细胞培养板加入20μL各浓度待测化合物、80μLLB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，海盐10g，蒸馏水1L，pH7.4)和100μL×106CFU/mL菌悬液，平行3组。以氨苄西林作为阳性对照药物，甲醇作为阴性对照。25℃培养12～48h，每12h观察各孔细菌的生长情况，对比阳性对照、阴性对照观察，无细菌生长培养孔中的最小浓度即为该化合物对病原菌的MIC值。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物1：[α]25D=-260(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.36～5.43(2H, m, H-4, H-5), 5.18～5.26(2H, m, H-13, H-14), 3.92(2H, qd,J=16.8, 3.5Hz, H-6'), 3.67(1H, br s, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.01 (1H, brs, H-10a), 1.89～1.70 (4H, m, H-7, H-9), 1.52(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.47(3H, s, H-12), 1.11 (2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.87(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.5(C, C-4'), 192.6(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 132.3(CH, C-5/C-13), 131.1(CH, C-5/C-13), 127.9(CH, C-4/C-14), 127.8(CH, C-4/C-14), 102.2(C,C-3'), 69.3(CH, C-5'), 59.9(CH2, C-6'), 49.8(C, C-2), 46.4(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.4(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.8(CH, C-8), 29.4(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.5(CH3, C-12)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故将化合物1鉴定为equisetin。

化合物2：[α]25D=-105(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.33～5.41(2H, m, H-4, H-5), 5.33(1H, m, H-13), 5.13(1H, brs, H-14), 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6'), 3.69(1H, brs, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.00(1H, brs, H-10a), 1.88～1.69(4H, m, H-7, H-9), 1.50(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.48(3H, brs, H-12), 1.07～1.14(2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.88(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.3(C, C-4'), 192.1(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 131.8(CH, C-5/C-13), 130.9(CH, C-5/C-13), 128.7(CH, C-4/C-14), 127.9(CH, C-4/C-14), 102.2(C, C-3'), 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6'), 49.9(C, C-2), 46.1(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.3(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.7(CH, C-8), 29.5(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.8(CH3, C-12)。该化合物的波谱数据与化合物1相似，其中1H NMR中δH: 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6')和13C NMR中δC: 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6')与化合物1有细微差别，以上数据与文献[9,13]报道基本一致。因此鉴定化合物2为equisetin的差向异构体5'-epiequisetin。

化合物3：1H NMR(700MHz, DMSO-d6)δH: 7.84(1H, s, H-6), 7.63(1H, s, H-9), 2.46(3H, s, H-11), 2.43(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, DMSO-d6)δC: 161.9(C, C-4), 152.5(C, C-2), 150.8(C, C-10a), 149.2(C, C-9a), 143.7(C, C-5a), 142.4(C, C-8), 137.8(C, C-7), 130.8(C, C-4a), 128.6(CH, C-6), 125.8(CH, C-9), 20.2(CH3, C-12), 19.6(CH3, C-11)。该化合物的波谱数据与文献[14]报道的lumichrome基本一致，故化合物3鉴定为lumichrome。

化合物4：1H NMR(700MHz,CD3OD)δH: 7.54(1H, d,J=7.7Hz, H-4), 7.32(1H, d,J=8.4Hz, H-1), 7.08(2H, m, H-3, H-7), 7.00(1H, td,J=7.7, 1.1Hz, H-2), 3.46(2H, t,J=7.4Hz, H-9), 2.93(2H, t,J=7.4Hz, H-10), 1.91(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 173.3(C, C-11), 138.2(C, C-6), 128.8(C, C-5), 123.3(CH, C-7), 122.3(CH, C-2), 119.6(CH, C-3), 119.2(CH, C-4), 113.3(C, C-8), 112.2(CH, C-1), 41.6(CH2, C-10), 26.2(CH2, C-9), 22.6(CH3, C-12)。该化合物的波谱数据与文献[15]报道的N-乙酰基色胺(N-acetyltryptamine)基本一致，故化合物4鉴定为N-乙酰基色胺。

化合物5：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 5.31～5.39(4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13), 2.78(2H, t,J=7.0Hz, H-11), 2.26(2H, t,J=7.4Hz, H-2), 2.03～2.08(4H, m, H-8, H-14), 1.60(2H, m, H-3), 1.29～1.34(14H, m, H-4, H-5, H-6, H-7, H-15, H-16, H-17), 0.91(3H, q,J=7.0Hz, H-18);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 178.6(C, C-1), 130.9(CH, C-13, C-9), 129.1(CH, C-10, C-12), 35.6(CH2, C-2), 32.7(CH2, C-16), 30.7(CH2, C-7), 30.5(CH2, C-6), 30.3(CH2, C-5), 30.3(CH2, C-15), 30.2(CH2, C-4), 28.2(CH2, C-8), 28.1(CH2, C-14), 26.5(CH2, C-11), 26.3(CH2, C-3), 23.6(CH2, C-17), 14.4(CH3, C-18)。该化合物的波谱数据与文献[16]报道的亚油酸linoleic acid基本一致，故化合物5鉴定为亚油酸。

化合物6：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.06(2H, d,J=11.9Hz, H-2, H-6), 6.72(2H, d,J=11.9Hz, H-3, H-5), 3.64(3H, s, H-9), 3.51(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.5(C, C-8), 157.5(C, C-4), 131.3(CH, C-2, C-6), 126.3(CH, C-3, C-5), 116.2(C, C-1), 52.4(CH3, C-9), 40.9(CH2, C-7)。该化合物的波谱数据与文献[17]报道的对羟基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物6鉴定为对羟基苯乙酸甲酯(methyl(4-hydroxyphenyl)acetate)。

化合物7：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.08(2H, m, H-4, H6), 6.76(2H, m, H-3, H-5), 3.67(3H, s, H-9), 3.60(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.7(C, C-8), 156.7(C, C-2), 132.0(CH, C-4), 129.4(CH, C-6), 122.5(C, C-1), 120.4(CH, C-5), 115.8(CH, C-3), 52.3(CH3, C-9), 36.4(CH2, C-7)。该化合物的波谱数据与文献[18]报道的邻羟基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物7鉴定为邻羟基苯乙酸甲酯(methyl(2-hydroxyphenyl)acetate)。

2.2 化合物抑菌活性测定

滤纸片琼脂扩散法筛选抑菌活性化合物结果显示(图3)，化合物1、2、5对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分别具有不同程度的抑制作用。改良肉汤稀释法测定MIC值结果显示(表1)，化合物1、2、5的最小抑菌浓度值为2.0～125μg/mL。

3 讨论

图3 化合物1、2、5和6(10mg/mL)对病原菌作用24h的抑菌效果Fig.3 Inhibitory effects of compounds 1～2 and 5～6 (10mg/mL) against pathogenic bacteria after 24h

表1 化合物1、2和5的最小抑菌浓度值Tab.1 The MIC values of compounds 1, 2 and 5

本文从海绵来源的共附生真菌Fusarium equisetiSCSIO 41019中共分离得到8个化合物，包括2个tetramic acid类生物碱(1～2)、1个异咯嗪类生物碱(3)、1个吲哚类生物碱(4)和4个聚酮类化合物(5～8)，并测试了其对金黄色葡萄球菌和MRSA的抑制活性，其中化合物1、2和5对受试病原菌具有一定的抑菌活性。据报道，equisetin(1)具有抑菌、细胞毒和抑制HIV病毒等生物活性，是抗HIV病毒感染的重要先导化合物之一[9,13,20]。本次抑菌活性结果表明equisetin(1)对金黄色葡萄球菌和耐MRSA具有强抑制活性，MIC值分别为2.0和3.9μg/mL，但是5'-epiequisetin(2)却表现出中等抑菌活性，MIC值均为31.2μg/mL，说明化合物1中5'S构型有利于提高其抑菌活性。此外，脂肪酸类化合物linoleic acid(5)在内生真菌代谢产物中较为常见且具有一定的抗菌活性，说明其可以参与形成化学防御体系保护宿主免受侵害[21-23]。本研究丰富了该菌次级代谢产物的化学多样性，也为将equisetin类化合物开发为具有抑菌活性的先导化合物提供了一定的参考。