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酶法制备头孢克洛的工艺优化

2019-10-10莫俊恺刘帅朱晓媛韦晓菊黎继烈

中国抗生素杂志 2019年9期
关键词:底物头孢收率

莫俊恺 刘帅 朱晓媛 韦晓菊 黎继烈,*

(1 中南林业科技大学林业生物技术湖南省重点实验室,长沙 410004;2 长沙凯晓生物科技有限公司,长沙 410006)

头孢克洛(cefaclor),化学名为(6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-苯基乙酰氨基]-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物,属于第二代头孢菌素。由美国Lilly公司研发[1],其杀菌机制是阻碍细菌细胞壁的合成,对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌均具有很强的杀灭作用[2],临床上主要用于皮肤及软组织感染[3]。目前头孢克洛工业生产多采用化学半合成法,包括酰氯法和混合酸酐法,反应步骤多,条件苛刻,且污染严重[4];而利用青霉素酰化酶催化合成头孢克洛具有很好的选择性,活性位点无需保护即可反应,明显缩减了反应步骤,操作更加简单,无毒害,成本低、收率高[5],是一种具有良好应用前景的绿色合成技术[6],已经成为了当今制药的热点。目前人们研究较多的是如图1所示的用合成用固定化青霉素酰化酶生产头孢克洛。

本文中以7-ACCA为母核,D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐为侧链,合成用固定化青霉素酰化酶为催化剂,催化合成头孢克洛。通过对底物质量浓度、反应温度、反应pH的调整和优化,提供了较好的工艺线路,提高了反应的转化率并且确保了酶的反应批次及收率,也促进了酶法制备头孢克洛的产业化。

图1 合成用固定化青霉素酰化酶产头孢克洛Fig.1 Production of cefaclor by synthetic immobilized penicillin acylase

1 材料与方法

1.1 材料

合成用固定化青霉素酰化酶(湖南南北旺生物技术有限公司);头孢克洛标准品(江苏苏州中联化学制药有限公司);7-ACCA、D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(浙江普洛制药有限公司);其它试剂(市售分析纯)。

1.2 方法

1.2.1 7-ACCA含量测定及转化率、收率计算

(1)HPLC分析条件:

色谱柱:Hyperclone C18柱(250mm×4.60mm, 5μm);流动相配制:称取6.8g磷酸二氢钾溶于1000mL纯化水,用1mol/L的NaOH溶液调pH至3.4,用0.22μm滤膜过滤,取920mL加入80mL乙腈(92:8),超声脱气20min左右;流速:1mL/min;检测:UV检测:254nm;样品测定:取待测液0.5mL至50mL容量瓶,用纯化水稀释定容至刻度;进样量:20μL。

(2)转化率及收率计算:

转化率=[1-转化后7-ACCA残留量/(转化前7-ACCA残留量)]×100%,残留量(mol);收率=转化后头孢克洛的生成/头孢克洛的理论生成。

1.2.2 转化反应

在合成反应器中加入称量好的合成用固定化青霉素酰化酶(酶投入量与母核同质量),确定7-ACCA底物浓度,让其溶解于水中,用氨水调节pH至8.0,待其溶解充分后投入合成反应器中,溶解后的侧链D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(投入量为7-ACCA摩尔数的1.2倍)缓慢滴加入酶反应体系(开始滴加后准确记录反应时间),开启搅拌,过程中用3mol/L氨水及6mol/L盐酸自动控制pH,同时控制反应温度,反应1h侧链滴加完毕。取起始样以及每隔1h取样,进行HPLC分析,计算转化率和收率。

1.2.3 分离精制

反应结束后,用100目筛网分离酶和粗粉、清液,抽滤收集粗粉,抽滤后的清液再洗酶和粗粉,多次过滤,多次用清液洗酶,直至过筛清液基本澄清,过滤后清液清亮、色浅,酶回收套用。收集粗粉湿品后,20~30℃溶于清液,搅拌为无结块的匀浆后,用盐酸调pH1以下(0.5~0.7),至粗粉全溶(溶解液外观澄清透明),加入活性炭搅拌脱色后抽滤,收集滤液。搅拌滤液,控制温度15~20℃,加浓氨水调pH值1.0左右,加入少量晶种后继续调pH1.5左右(开始析出,pH自然降到1.1左右)。再降温至10℃,养晶0.5h,再继续缓慢调pH至3.8(pH会上升到4.5左右)。降温至5℃,搅拌养晶2h。抽滤结晶液,将湿粉35℃下真空干燥得到精品。通过精品与标准品的HPLC图谱对比,得到两者含量与杂质的对比结论。

2 结果与分析

2.1 底物质量浓度对转化率和收率的影响

将7-ACCA配成质量浓度为160、170、180、190及200g/L的底物溶液,在相同的温度15℃及pH6.0条件下分别进行转化反应,HPLC分析并计算转化率和收率(图2)。结果显示转化率和收率随着底物质量浓度增加而降低,是因为在反应过程中,较高的质量浓度将产生高浓度的产物抑制作用,从而影响反应,而较低的底物质量浓度虽然不会抑制反应,但最终产物浓度不高,更多的副产物、更高的分离成本将是十分严峻的问题,最终确定底物质量浓度控制在170~190g/L内效果最佳。

2.2 转化温度对转化率和收率的影响

控制温度为10、15、20、25和30℃,在相同的底物浓度180g/L、pH6.0条件下分别进行转化反应,HPLC分析计算转化率和收率(图3)。结果显示反应温度在15℃时,转化率和收率最高,随着温度的继续上升,转化率开始下降。说明低温使能耗增加,时间延长;而温度过高,侧链加速分解,从而使合成酶活力不稳定。最终确定反应温度在10~20℃范围内效果最佳。

图2 底物浓度对转化率和收率的影响Fig.2 The effect of substrate concentration on the conversion rate and the yield

图3 转化温度对转化率和收率的影响Fig.3 The effect of reaction temperature on the conversion rate and the yield

2.3 转化pH对转化率和收率的影响

控制pH5、5.5、6、6.5和7,在相同的温度15℃及底物浓度条件180g/L条件下下分别进行转化反应,HPLC分析计算转化率和收率(如图4)。结果显示pH6~7时均有较高的转化率,当pH小于6或大于7时,转化率和收率下降明显。这是由于在碱性环境中会加快侧链的分解速度,产物的稳定性无法得到保证,导致影响最终收率。最终确定反应最适pH在6.0~7.0范围内效果最佳。

2.4 酶法制备头孢克洛响应面优化

2.4.1 Box-Behnken实验设计及结果

图4 转化pH对转化率和收率的影响Fig.4 The effect of reaction pH on the conversion rate and the yield

根据单因素试验结果,选择以上3因素:底物浓度(A)、转化温度(B)、转化pH(C)为影响因素,以反应转化率(Y)为响应值。每个因素取3个水平以(-1、0、1)为编码,用Box-Benhnken试验设计,各因素及水平设计见表1,并依据表2的设计出的17组方案进行实验,结果见表3。所得二次回归拟合方程为:

结果如表3所示,本实验所建立的模型中底物浓度(A)、转化温度(B)、转化pH(C)以及B2、C2达到极显著水平,A2达到显著水平。模型P<0.0001,失拟项P=0.0872>0.05,表示模型极显著、失拟项不显著,表示上述方程对实验的拟合度良好,相关系数R2=0.9893说明模型拟合度较好。

2.4.2 响应面模型拟合及实验验证

如图5~7所示,利用Design-Expert 8.0.6软件绘出响应面分析图及其等高线,该图可生动形象描绘各因素之间的关系。从响应面图来看,若图形曲面的斜率越高(即坡度越大)说明该因素对转化率的影响越显著,当其中一个因素固定不变时,也可以看出另外两个因素的交互作用对转化率的影响;从等高线图来看,其可以反映因素之间的相互作用,若等高线的形状越接近圆形说明交互作用越弱,越接近椭圆形越强。

表1 Box-Benhnken 设计因素水平表Tab.1 Variables and levels in Box-Behnken design

表2 中心组合试验设计与结果Tab.2 Box-Behnken design format and data

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance for quadric regression model

根据软件分析模型的最佳水平为:底物浓度175.81g/L、转化温度13.9℃、转化pH6.43,可得转化率理论最大值为98.2%。为检查上述结果的可靠性,进行3次平行实验,测得头孢克洛转化率为(98.2±0.3)%,与预测值相当接近,说明该模型可很好地反映试验结果具有一定的可靠性。

2.5 合成用固定化青霉素酰化酶稳定性检测

在最优转化条件下(7-ACCA质量浓度175.8g/L、温度13.9℃、pH6.43)将合成用固定化青霉素酰化酶回收,重复进行多批转化反应,利用高效液相色谱计算每批次转化率和转化时间,对在最优反应体系下合成头孢克洛的效果以及合成用固定化青霉素酰化酶的稳定性(如表4、图8)进行验证。由表4、图8可以看到整个转化反应重复进行了126批次转化合成反应,在前46批次转化合成反应中,平均反应时间在178min,平均转化率高达97.8%;在47~86批次中平均反应时间上升至206min,转化率依略有下降;87~111批的结果与前一批结果基本相似;第112~126批次平均反应时间显著上升,平均转化率也降至95.5%,原因主要是固定化酶长期回收使用后,内部构象产生了变化,部分酶分子与载体共价键断裂,导致其活性下降。综上,在最优转化条件下合成用固定化青霉素酰化酶稳定性良好,在多批次反复使用后活力依旧可观;同时计算出126批反应批次中的平均转化率高达97.1%,同时收率平均也达到了95%以上,验证了此反应体系对于酶法制备头孢克洛的工艺优化是可行的。

2.6 头孢克洛精品与标准品的数据对比

通过转化反应与分离精制后得到头孢克洛精品,已知头孢克洛标准品含量约为99%,利用HPLC外标法得到头孢克洛精品含量为:

图5 底物浓度与转化温度的交互作用对转化率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of mass concentration of substrate and reaction temperature on the conversion rate

图6 底物浓度与转化pH的交互作用对转化率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of mass concentration of substrate and reaction pH on the conversion rate

图7 转化温度与转化pH的交互作用对转化率影响的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of reaction temperature and reaction pH on the conversion rate

表4 多批次转化酶活力衰减及转化率情况Tab.4 The situation of energy attenuation and conversion rate of multiple batches of invertase

头孢克洛精品含量=99%×[C(头孢克洛标准品)×S(头孢克洛精品)/C(头孢克洛标精品)×S(头孢克洛准品),其中,C为浓度;S为液相图谱中峰面积。

图9~10分别为头孢克洛精品与头孢克洛标准品HPLC图谱,确定浓度后可得:头孢克洛标准品浓度30.11(mg/100mL),头孢克洛标准品液相图谱峰面积7777.532;头孢克洛精品浓度29.62(mg/100mL),头孢克洛精品液相图谱峰面积7561.295。

综上计算:头孢克洛精品含量为98.7%,与标准品相差很小,根据图谱对比可知杂质残留与标准品基本一致。

图8 多批次转化酶活力衰减及转化率情况Fig.8 The situation of energy attenuation and conversion rate of multiple batches of invertase

3 结论与讨论

图9 精制后头孢克洛精品HPLC图谱Fig.9 The HPLC chromatogram of cefaclor boutiques after refined

图10 头孢克洛标准品HPLC图谱Fig.10 The HPLC chromatogram of cefaclor standards

本实验采用合成用固定化青霉素酰化酶催化母核7-ACCA和侧链苯甘氨酸甲酯盐酸盐在水相体系中转化合成头孢克洛,利用HPLC对母核进行定量分析,追踪母核7-ACCA转化率。单因素实验结果表明:在温度10~20℃、pH6.0~7.0、底物浓度170~190g/L下,该实验效果最佳。得到各单因素最优范围后,采用Box-Behnken试验设计及响应面分析法预测出最佳反应条件为:底物浓度175.81g/L、转化温度13.9℃、转化pH6.43,经试验验证,测得7-ACCA酶法制头孢克洛转化率为(98.2±0.3)%,与预测值接近。通过精制后头孢克洛精品与头孢克洛标准品的HPLC图谱对比与分析,可确认两者含量与杂质残留基本一致。固定化酶酶法合成头孢克洛避免了传统化学合成方法中的有毒有害物质,且工艺路线简单,条件温和,转化时间短,而且获得了较高的转化率,同时合成用固定化青霉素酰化酶具有可多次重复使用等优点。该工艺为进一步放大研究和中试乃至工业生产打下了坚实基础,也将会对酶法合成抗生素的发展产生深远影响。

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