鲫鱼脑孢子的早期检测

祭仲石 朱建楼 韦 艳 王中清 厉成新

鲫鱼脑孢子学名洪湖碘泡虫，感染了洪湖碘泡虫的鲫鱼在咽喉部形成孢囊，孢囊内存在大量孢子，随着孢子虫的繁殖，孢囊扩大，咽喉部肿大，堵塞咽喉造成鲫鱼吃食不便、体型消瘦、眼球突出、鳃盖外张无法闭合。该病一般在每年6月中旬开始暴发，最长可持续到11月，广泛流行于江苏、湖北、湖南等地区，死亡率高达80%。不幸的是，到目前为止，对洪湖碘泡虫的生活史、感染途径等还不清楚，缺乏相关基础研究，且洪湖碘泡虫在鲫鱼体内形成成熟的孢子后，外面会形成坚硬的几丁质外壳，一般的药物很难进入，无法达到良好的治疗效果，因此，对鲫鱼脑孢子虫的重点工作在于早期预防。

目前检测脑孢子虫主要以显微镜或者肉眼观察发病部位判断孢子虫发病情况，检测结果因人而异，准确性低，时效性差，传统方法难以有效诊断处于易于治疗的营养体时期。因此我们使用分子生物学方法，探索分子检测方法在鲫鱼脑孢子虫的早期检测中的可行性，为鲫鱼养殖过程中脑孢子虫的早期防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

各种孢子虫样品和实验鱼样品于2019年6月取自江苏大丰某鲫鱼养殖塘口，基因组DNA提取试剂盒、PCRMix采购自天根生化科技有限公司；溴化乙锭（EB）等购自北京艾德莱；扩增引物由上海生工合成。

1.2 脑孢子虫基因组的提取

在实验室中，取6尾发病鲫鱼，将咽喉部孢囊剪开，取100mg左右孢子虫样品，加100μL的0.7%生理盐水稀释后用细胞破碎器研磨成糊状，再用基因组DNA 提取试剂盒，按照说明书进行操作提取总基因组，基因组置于冰箱( -20 ℃) 中保存备用。

1.3 基因组DNA的PCR扩增

采用洪湖碘泡虫特异引物扩增样脑孢子虫基因组，引物序列如表1 所示。PCR 反应体系( 20μL) ： 10μL 2×Taq PC R MasterMix ，2μL 引物(MhF 1 μL、MhR 1 μL) ，1 μL DNA，7μLddH2O。PCR 反应程序： 95℃下预变性5 分钟; 94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸30秒，共进行32 个循环; 最后在72℃下延伸10分钟，于4℃下保温30分钟。PCR 产物用添加溴化乙锭（EB）的1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 引物序列

1.4 临床样品检测

于2019年6月在江苏大丰某鲫鱼养殖塘口料台使用旋网取10尾鲫鱼，在显微镜下观察无明显孢子虫症状，然后根据分子检测方法进行鲫鱼脑孢子虫的分子检测。

2 结果分析

2.1 患病鲫鱼临床症状

患病鲫鱼如图1，感染了洪湖碘泡虫的鲫鱼在咽喉部形成孢囊，孢囊内存在大量孢子虫，随着孢子虫的繁殖，孢囊扩大，咽喉部肿大充血，堵塞咽喉造成鲫鱼吃食不便、体型消瘦、眼球突出、鳃盖外张无法闭合。剪开咽喉部，可见大量白色豆腐渣状孢囊，显微镜下观察，成熟的脑孢子虫呈瓜子状，前尖后圆，孢子前段具有两个极囊。

2.2 脑孢子虫基因组PCR结果

鲫鱼脑孢子虫基因组的PCR电泳图谱如图2，其中1-6号为脑孢子虫实验样品，7号使用ddH2O为模板作为阴性对照。电泳结果显示，1-6号样品在479bp左右有亮带，阴性对照没有出现条带，与预期结果相同，说明该方法可以用于鲫鱼脑孢子虫的检测。

2.3 临床样品检测结果

图3结果显示，显微镜检查没有孢子虫感染的鲫鱼，通过分子检测方法，10尾样品中共检出四4尾感染孢子虫。说明在传统检测方法无法检测处于感染脑孢子早期的鲫鱼，分子检测方法在鲫鱼脑孢子的临床检测中检出率高，实用性强，在生产中有一定的利用价值。

图3 鲫鱼样品PCR图谱

图1 鲫鱼感染脑孢子虫症状

图2 脑孢子虫基因组凝胶电泳图谱

3 讨论

近年来鲫鱼“脑孢子虫病”来势猛、传播快、死亡率高，给养殖户造成了较大的经济损失，是威胁鲫鱼养殖最严重的寄生虫病害。而及时发现病情，及时治疗是关键。在鲫鱼脑孢子虫检测中，传统方法的主观性较强，对结果的误判较高，大量的研究表明脑孢子虫的分子检测比传统的显微镜检查灵敏度高。

脑孢子在感染早期，鲫鱼没有明显感染症状，一般到每年的6月中旬才开始大规模发病，因而难以发现，难以及时用药物进行防治。本文结果说明鲫鱼感染早期还未大规模暴发时就可以检测出，因此可以在鲫鱼没有大规模感染的时候，通过定期分子检测，及时发现是否存在脑孢子虫感染。在鲫鱼感染脑孢子早期检测出来，及时投喂盐酸氯苯胍、地克珠利、槟榔散等药物进行驱虫，同时使用环烷酸铜、敌百虫等药物进行水体杀虫，将脑孢子控制在发病前期，减少大规模暴发带来的损失。同时，该方法还可以用于鲫鱼鱼种的检测，在采购鲫鱼鱼种时，对鱼种进行脑孢子虫的分子检测，确认鱼种是否携带脑孢子虫，择优选择鱼种，保障养殖安全。与传统显微镜检测手段相比，分子检测方法大大提高了疾病的检出成功率。既解决了鱼种阶段难以有效判断疾病的难题，更为成鱼养殖过程中精准用药提供了宝贵数据支撑。